In Vitro Reconstitution of Mevalonate Pathway and Targeted Engineering of Farnesene Overproduction in Escherichia coli
- 作者
- Fayin Zhu, Xiaofang Zhong, Mengzhu Hu, Lei Lu, Zixin Deng, Tiangang Liu
- 单位
- Key Laboratory of Combinatorial Biosynthesis and Drug Discovery (Wuhan University), Ministry of Education, and Wuhan University School of Pharmaceutical Sciences, Wuhan 430071, PR China; Hubei Engineering Laboratory for Synthetic Microbiology, Wuhan Institute of Biotechnology, Wuhan 430075, PR China
- 杂志
- Biotechnology and Bioengineering（2014）
- DOI
- 10.1002/bit.25198
- 所属领域
- 代谢工程/合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
由于缺乏稳态动力学信息和萜类生物合成通路的深入理解，难以构建高效通用的微生物萜类生产系统。
研究策略
通过体外重构甲羟戊酸（MVA）途径生产法尼烯，利用体外系统获得的稳态动力学和酶学信息指导大肠杆菌体内途径的靶向优化与工程改造，并结合靶向蛋白质组学和中间代谢物分析评估菌株代谢状态。
研究路线图
核心内容
本研究通过体外重构甲羟戊酸途径合成法尼烯，利用纯化蛋白搭建无细胞体系，定量解析各酶稳态动力学特征，据此指导大肠杆菌体内途径的靶向工程改造。结果显示，体外系统优化后法尼烯产量提升6倍，最大转换率约0.4 s⁻¹，并确定异戊烯基焦磷酸异构酶（Idi）为限速关键酶。基于此，在工程菌F1中过表达Idi获得F4菌株，48小时法尼烯产量达731 mg/L，较F0提高2000倍，96小时达到1.1 g/L；Idi浓度增加17倍显著提升初始反应速率。靶向蛋白质组学和中间代谢物分析进一步揭示，过表达ERG13导致HMG-CoA积累，过表达ERG8引起IPP/DMAPP积累，均抑制细胞生长，据此优化了九种蛋白的摩尔配比。该工作证实体外重构系统能提供精确动力学信息，有效指导体内多步生物合成途径的靶向优化，为其他萜类化合物的高效生产提供了可推广的策略。
创新点
['首次利用纯化蛋白完全体外重构MVA途径合成法尼烯', '基于体外系统定量分析确定Idi为关键酶，并通过体内过表达实现产量大幅提升', '结合靶向蛋白质组学和中间代谢物分析精确评估工程菌株代谢状态']
研究对象（10）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3) | 甲羟戊酸途径法尼烯合成 | atoB | AtoB | 催化 | 乙酰-CoA乙酰转移酶，来自E. coli |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 甲羟戊酸途径法尼烯合成 | ERG13 (hmgs) | ERG13 | 催化 | HMG-CoA合酶，来自S. cerevisiae |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 甲羟戊酸途径法尼烯合成 | tHMG1 (thmg1) | tHMG1 | 催化 | 截短的HMG-CoA还原酶，来自S. cerevisiae |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 甲羟戊酸途径法尼烯合成 | ERG12 | ERG12 | 催化 | 甲羟戊酸激酶，来自S. cerevisiae |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 甲羟戊酸途径法尼烯合成 | ERG8 | ERG8 | 催化 | 磷酸甲羟戊酸激酶，来自S. cerevisiae |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 甲羟戊酸途径法尼烯合成 | MVD1 (ERG19) | MVD1 | 催化 | 甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶，来自S. cerevisiae |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 甲羟戊酸途径法尼烯合成 | idi | Idi | 催化 | 异戊烯基二磷酸异构酶，来自E. coli，被鉴定为关键酶 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 甲羟戊酸途径法尼烯合成 | ispA | IspA | 催化 | 法尼基焦磷酸合酶，来自E. coli |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 甲羟戊酸途径法尼烯合成 | afs | AFS | 催化 | α-法尼烯合酶，来自Malus x domestica，经密码子优化 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 甲羟戊酸途径法尼烯合成 | ALF (ispA-afs fusion) | ALF | 催化 | IspA与AFS通过(GGGS)2连接子融合的嵌合蛋白 |
关键发现
- 体外重构系统优化后法尼烯产量提高6倍，最大转换率约0.4 s⁻¹。工程菌F1生产130 mg/L法尼烯（比对照F0高400倍）
- F4菌株（额外过表达Idi）48小时生产731 mg/L，比F1提高5.5倍，比F0提高2000倍，96小时达1.1 g/L。Idi浓度增加17倍提高初始速率。过表达ERG13导致HMG-CoA积累，过表达ERG8导致IPP/DMAPP积累，均抑制生长。最佳蛋白摩尔比AtoB:ERG13:tHMG1:ERG12:ERG8:MVD1:Idi:IspA:AFS=1:10:2:5:5:2:5:2:2。
研究结论
体外重构的MVA途径系统能提供精确的动力学和代谢信息，指导体内靶向工程实现萜类化合物高产，该策略可推广至其他多步生物合成途径。