A Kinetic-Based Approach to Understanding Heterologous Mevalonate Pathway Function in E. Coli
- 作者
- Lane J. Weaver, Mirta M. L. Sousa, George Wang, Edward Baidoo, Christopher J. Petzold, Jay D. Keasling
- 单位
- Joint BioEnergy Institute, 5885 Hollis Avenue, Emeryville, California 94608; UCB-UCSF Joint Graduate Group in Bioengineering, Berkeley, California 94720; Physical Biosciences Division, Lawrence Berkeley National Laboratory, Berkeley, California 94720; Department of Chemical & Biomolecular Engineering, University of California, Berkeley, California 94720; Department of Cancer Research and Molecular Medicine, Faculty of Medicine, Norwegian University of Science and Technology (NTNU), Trondheim NO-7489, Norway; The Proteomics and Metabolomics Core Facility (PROMEC) at NTNU, Trondheim, Norway
- 杂志
- Biotechnology and Bioengineering（2015）
- DOI
- 10.1002/bit.25323
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
异源甲羟戊酸途径在大肠杆菌中的产量、滴度和生产率受多因素影响，缺乏预测性模型来指导工程改造；传统通量模型不显式处理酶浓度，难以直接与实验衔接。
研究策略
构建基于常微分方程的动力学模型，采用文献动力学参数和SRM-MS测定的绝对酶浓度进行参数化；利用全局敏感性分析识别关键参数；通过构建同源甲羟戊酸激酶（saMK）和过表达紫穗槐二烯合酶（10kADS）两个工程菌株进行实验验证。
研究路线图
核心内容
该研究以大肠杆菌DH1为底盘，针对异源甲羟戊酸途径生产紫穗槐二烯过程中产量受多因素影响、缺乏预测性模型的问题，构建了基于常微分方程的动力学模型。模型采用文献报道的酶动力学参数和通过SRM-MS定量蛋白质组学测得的绝对酶浓度进行参数化，并利用全局敏感性分析识别关键调控节点，随后通过构建表达同源甲羟戊酸激酶（saMK）和过表达紫穗槐二烯合酶（10kADS）的工程菌株进行实验验证。关键结果包括：体内ADS的kcat为0.022 ± 0.008 s⁻¹，约为体外值的3倍；10kADS菌株中ADS表达量增加约10倍，浓度达约600 μM，约占总蛋白的20%；FPP浓度始终高于ADS的KM（3.3 μM），表明酶处于饱和状态；甲羟戊酸激酶的FPP反馈抑制常数在三个数量级内变化时，生产率波动不超过3%。模型预测与实验测定高度一致，尤其采用体内kcat时更为准确。研究揭示紫穗槐二烯合酶是当前途径的主要瓶颈，而甲羟戊酸激酶的反馈抑制并非限制因素，表明该动力学建模方法能有效指导异源途径的理性工程改造。
创新点
将定量蛋白质组学（SRM-MS）与动力学建模相结合，获得绝对酶浓度用于模型参数化；全局敏感性分析指导实验设计；成功预测实验菌株的生产率并验证了关于反馈抑制的假设。
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli DH1 | 甲羟戊酸途径（下游） | scMK | 酿酒酵母甲羟戊酸激酶 (S. cerevisiae mevalonate kinase) | 催化 | 催化甲羟戊酸磷酸化；受FPP反馈抑制，Ki=1.9 μM |
| Escherichia coli DH1 | 甲羟戊酸途径（下游） | saMK | 金黄色葡萄球菌甲羟戊酸激酶 (S. aureus mevalonate kinase) | 催化 | 来自金黄色葡萄球菌的同源激酶，其FPP反馈抑制Ki比scMK弱24倍 |
| Escherichia coli DH1 | 甲羟戊酸途径（下游） | scPMK | 酿酒酵母磷酸甲羟戊酸激酶 (S. cerevisiae phosphomevalonate kinase) | 催化 | 催化磷酸甲羟戊酸磷酸化 |
| Escherichia coli DH1 | 甲羟戊酸途径（下游） | scPMD | 酿酒酵母二磷酸甲羟戊酸脱羧酶 (S. cerevisiae phosphomevalonate decarboxylase) | 催化 | 催化二磷酸甲羟戊酸脱羧形成IPP |
| Escherichia coli DH1 | 甲羟戊酸途径（下游） | ecIDI | 大肠杆菌异戊烯基焦磷酸异构酶 (E. coli IPP isomerase) | 催化 | 催化IPP与DMAPP的异构化 |
| Escherichia coli DH1 | 甲羟戊酸途径（下游） | ecISPA | 大肠杆菌法尼基焦磷酸合酶 (E. coli FPP synthase) | 催化 | 催化IPP与DMAPP缩合生成FPP |
| Escherichia coli DH1 | 甲羟戊酸途径（下游） | aaADS | 青蒿紫穗槐二烯合酶 (Artemisia annua amorphadiene synthase) | 催化 | 催化FPP环化生成紫穗槐二烯；在10kADS菌株中表达增加约10倍 |
关键发现
- 体内ADS的kcat为0.022±0.008 s^-1，约为体外值(0.0068 s^-1)的3倍
- 10kADS菌株ADS表达增加约10倍，浓度达约600 μM（约为总蛋白的20%）
- FPP浓度在实验过程中始终饱和ADS（KM=3.3 μM）
- 甲羟戊酸激酶的FPP抑制常数在3个数量级范围内变化时，紫穗槐二烯生产率变化不超过3%
- 模型预测与实验测定的生产率高度一致，尤其当使用体内kcat时。
研究结论
以实验测定的蛋白质浓度和酶动力学参数构建的动力学模型能够定性且较定量地预测异源甲羟戊酸途径的生产率，可用于检验工程策略；紫穗槐二烯合酶是当前途径的主要限制因素，而甲羟戊酸激酶的反馈抑制并非瓶颈。