Building Terpene Production Platforms in Yeast
- 作者
- Xun Zhuang, Joe Chappell
- 单位
- Departments of Plant & Soil Science and Pharmaceutical Sciences, University of Kentucky, Lexington, Kentucky
- 杂志
- Biotechnology and Bioengineering（2015）
- DOI
- 10.1002/bit.25588
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
植物和微生物天然合成萜类产量低且为混合物，化学合成成本高、选择性差，需要构建高效、通用的微生物细胞工厂来生产单一萜类化合物。
研究策略
以酿酒酵母BY4741为底盘，通过EMS随机诱变结合制霉菌素、squalestatin和胆固醇筛选获得可好氧摄取外源甾醇且甲羟戊酸途径可舍弃的SUE突变株；随后通过插入失活ERG9或ERG1阻断FPP流向甾醇，结合异源表达萜类合酶（HPS、SSL1-3）及截短型HMGR，系统提高FPP供给并验证倍半萜和三萜的生产能力。
研究路线图
核心内容
该研究以酿酒酵母BY4741为底盘，采用无偏的EMS随机诱变结合制霉菌素、squalestatin和胆固醇筛选，获得可好氧摄取外源甾醇且甲羟戊酸途径可舍弃的SUE突变株，进而通过敲除ERG9或ERG1阻断FPP流向甾醇，并异源表达萜类合酶及截短型HMGR，构建了通用萜类生产平台。关键结果显示，突变株ZX178-08积累法尼醇超过100 mg/L，表达prennaspirodiene合酶后产量达116 mg/L，约为亲本（10.94 mg/L）的10倍；共表达截短型HMGR后进一步升至170.23 mg/L，较未共表达增加约50%。该菌株表达SSL1-3嵌合酶可积累botryococcene超过60 mg/L；ERG1失活株ZXB整合tHMGR并表达藻源鲨烯合酶后，squalene产量约250 mg/L。该策略通过将随机遗传筛选与理性代谢工程结合，实现了内源甾醇途径的可替换化与FPP供给的系统提升，证明该平台对倍半萜和三萜具有良好的通用性，为构建高效萜类细胞工厂及后续全基因组解析提供了可行基础。
创新点
1）采用无偏的随机诱变与正向生长筛选，而非理性设计，获得具有可弃用甲羟戊酸途径的酵母；2）利用squalestatin抑制鲨烯合酶同时筛选能好氧摄取外源甾醇的SUE突变，使内源甾醇合成途径可被替换；3）通过ERG9/ERG1敲除与tHMGR表达组合，实现FPP池的大幅提升，并展示了该平台对倍半萜和三萜的通用性。
研究对象（9）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae BY4741 | 甾醇生物合成 | ERG9 | squalene synthase | 催化 | 通过插入失活ERG9（用潮霉素标记替换编码区），阻断FPP流向麦角固醇，形成erg9敲除株。 |
| BY4741来源的SUE突变株 | 甾醇摄取 | SUE突变的未表征基因 | — | 转运 | EMS诱变筛选获得，支持有氧条件下外源甾醇的摄取，使内源麦角固醇合成途径可被舍弃。 |
| ZX178-08 (erg9敲除的SUE突变株) | 倍半萜生物合成 | HPS | prennaspirodiene synthase | 催化 | 异源表达来自Hyoscyamus muticus的HPS，将FPP转化为prennaspirodiene。 |
| ZX178-08 | 甲羟戊酸途径 | tHMGR | 截短型仓鼠HMG-CoA还原酶 | 催化 | 共表达截短型仓鼠HMG-CoA还原酶，去除N端跨膜和调控域，增强MVA途径通量。 |
| ZX178-08 | 三萜生物合成 | SSL1-3融合基因 | botryococcene synthase（SSL1与SSL3的融合体） | 催化 | 表达Botryococcus braunii的SSL1-3嵌合体，将FPP转化为botryococcene。 |
| ZXA (ZX178-08的ERG1敲除株) | 三萜生物合成 | B. braunii squalene synthase基因 | squalene synthase | 催化 | 过表达藻源鲨烯合酶（GPD启动子），将FPP转化为squalene。 |
| ZXB (ZX178-08的ERG1敲除且整合tHMGR株) | 甲羟戊酸途径 | tHMGR | 截短型仓鼠HMG-CoA还原酶 | 催化 | 在ERG1位点插入失活的同时整合了截短HMGR基因，提供额外拷贝以增强通量。 |
| ZXB (ZX178-08的ERG1敲除且整合tHMGR株) | 三萜生物合成 | B. braunii squalene synthase基因 | squalene synthase | 催化 | 与ZXA类似表达藻源鲨烯合酶，但底盘为整合tHMGR的ZXB，squalene产量更高。 |
| ZXA和ZXB | 甾醇生物合成 | ERG1 | squalene epoxidase | 催化 | 插入失活ERG1，阻断鲨烯向环氧鲨烯转化，避免内源甾醇代谢消耗积累的鲨烯。 |
关键发现
- 成功构建了萜类生产平台。突变株ZX178-08积累法尼醇(FOH)大于100 mg/L；表达HPS后prennaspirodiene产量达116±23.64 mg/L，亲本BY4741仅10.94±3.12 mg/L（约10倍差）；共表达截短型HMRG后prennaspirodiene进一步提高至170.23±30.44 mg/L，较未共表达增加约50%；ZX178-08表达SSL1-3嵌合酶积累botryococcene大于60 mg/L（讨论中提>65 mg/L）；ERG1失活株ZXA过表达藻源鲨烯合酶后积累squalene
- 18 mg/L，而带有整合tHMGR的ZXB株squalene产量达约250 mg/L（FOH
- 24 mg/L），对照ZXB未表达SQS时FOH积累超过300 mg/L。此外，从46个产FOH的突变株中筛选出9个超过50 mg/L，并进一步获得11个ERG9敲除株产FOH超过70 mg/L。
研究结论
通过结合无偏遗传筛选与基因工程，获得了具有可弃用甲羟戊酸途径的酵母平台菌株（如ZX178-08、ZXA、ZXB），能高效积累倍半萜（prennaspirodiene）和三萜（botryococcene、squalene），且过表达截短型HMGR可进一步提升产量。该策略为构建通用萜类生产宿主提供了可行方案，并为后续全基因组关联研究奠定了基础。