Natural and engineered production of taxadiene with taxadiene synthase
- 作者
- Sameh Soliman, Yi Tang
- 单位
- Department of Chemical and Biomolecular Engineering, Department of Chemistry and Biochemistry, Department of Bioengineering, University of California, Los Angeles
- 杂志
- Biotechnology and Bioengineering（2017）
- DOI
- 10.1002/bit.25468
- 所属领域
- 代谢工程 / 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
紫杉醇（Paclitaxel）作为一种重要抗癌药物，其天然来源产量极低、化学合成步骤多且成本高。关键前体taxadiene的合成由限速酶taxadiene synthase（TXS）催化，如何提高TXS活性并实现taxadiene在异源宿主中的高效生产是核心问题。
研究策略
综述TXS的生化特性、晶体结构、代谢调控机制，并总结了通过代谢工程在不同宿主（大肠杆菌、酵母、植物）中重构和优化taxadiene生物合成路径，以及结合蛋白质工程改造TXS的策略。
研究路线图
核心内容
该研究系统综述了紫杉醇关键前体taxadiene的异源生物合成进展，重点聚焦限速酶taxadiene synthase（TXS）的生化特性与代谢工程改造策略。TXS的催化效率极低，其kcat仅为0.0106 s⁻¹，kcat/KM为3.5×10³ s⁻¹M⁻¹，比其他植物萜类环化酶低约两个数量级，是紫杉醇生物合成的核心瓶颈。研究梳理了在大肠杆菌、酵母及多种植物中重构taxadiene合成路径的代谢工程策略，包括通过多元模块化优化MEP途径与前体供给，在大肠杆菌中实现最高达1 g/L培养物的taxadiene产量，其中K株产量比B株高2.5倍。在酵母中组合表达Sulfolobus acidocaldarius来源的GGPPS、截短HMGR和突变转录因子UPC2-1后，taxadiene产量从0.2 mg/L提升至8.7 mg/L。植物宿主中，番茄果实表达TXS获得160 mg/kg果实产量，但伴随生长缓慢表型。TXS晶体结构解析为蛋白质工程提供原子水平蓝图，未来结合理性设计与定向进化有望进一步提升其活性。真菌来源的TXS同源酶虽存在争议，但可能成为发掘新催化元件的重要方向。
创新点
['系统总结了TXS的晶体结构及其催化机制，为蛋白工程提供原子水平蓝图', '比较了不同宿主中taxadiene生产的代谢工程策略，包括模块化途径优化、前体供给增强和调控元件改造', '讨论了真菌来源的可能TXS同源酶及真菌生产紫杉醇的争议性进展', '提出了结合理性设计和定向进化来优化TXS活性的未来方向']
研究对象（12）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli | MEP途径（非甲羟戊酸途径） | txs（来自Taxus brevifolia） | Taxadiene synthase (TXS) | 催化 | 异源表达TXS催化GGPP环化生成taxadiene，通过优化MEP途径产量达1 g/L |
| Escherichia coli | MEP途径 | dxs, dxr (dxp reductoisomerase) | DXP synthase, DXP reductoisomerase | 催化 | MEP途径中的限速酶，过表达可增加IPP前体供给 |
| Saccharomyces cerevisiae | 甲羟戊酸途径 | ggpps（来自Sulfolobus acidocaldarius） | Geranylgeranyl pyrophosphate synthase (GGPPS) | 催化 | 利用异源GGPPS合成GGPP，避免与类固醇合成竞争FPP |
| Saccharomyces cerevisiae | 甲羟戊酸途径 | truncated HMGR | 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase (HMGR) | 催化 | 截短HMGR去除了反馈抑制，增加MVA途径通量 |
| Saccharomyces cerevisiae | 甲羟戊酸途径 | UPC2-1（突变型） | UPC2-1 transcription factor | 调控 | 突变转录因子使酵母在有氧条件下摄取外源甾醇，增强萜类通量 |
| Arabidopsis thaliana | 类异戊二烯途径（MEP） | txs | Taxadiene synthase (TXS) | 催化 | 表达TXS产生60 μg/kg干重taxadiene，但因消耗GGPP导致致死表型 |
| Solanum lycopersicum（番茄） | 类胡萝卜素/二萜途径 | txs | Taxadiene synthase (TXS) | 催化 | 将GGPP从类胡萝卜素途径转向taxadiene，产量160 mg/kg果实，但影响赤霉素合成致生长缓慢 |
| Panax ginseng（人参） | 类异戊二烯途径 | txs | Taxadiene synthase (TXS) | 催化 | 转化人参根，产量9.1 μg taxadiene/g干重，无表型变化 |
| Nicotiana benthamiana | 类异戊二烯途径 | txs, 抑制phytoene synthase表达 | Taxadiene synthase (TXS), Phytoene synthase | 催化 | 在CaMV 35S启动子下表达TXS并抑制phytoene synthase，taxadiene产量约40 μg/g干重 |
| Physcomitrella patens（苔藓） | 二萜生物合成途径 | txs | Taxadiene synthase (TXS) | 催化 | 表达TXS，taxadiene产量达组织鲜重的0.05%，不影响内源二萜水平 |
| Taxus brevifolia（太平洋紫杉） | 紫杉醇生物合成途径 | txs | Taxadiene synthase (TXS) | 催化 | TXS首次分离自该植物，催化GGPP环化生成taxadiene，是紫杉醇生物合成第一步关键酶 |
| Paraconiothyrium SSM001（内生真菌） | 可能的真菌紫杉醇途径 | 未明确的真菌txs同源基因 | 推测的真菌TXS样蛋白 | 催化 | Western blot检测到大小与植物TXS相似的蛋白，但基因组测序尚未证实存在同源基因 |
关键发现
['TXS的催化活性(kcat/KM = 3.5×10^3 s^-1 M^-1)比其他植物萜类环化酶低约两个数量级，kcat仅为0.0106 s^-1，表明其是紫杉醇生物合成的限速步骤', '在大肠杆菌中通过多元模块化方法，taxadiene产量最高可达1 g/L培养物', '在大肠杆菌K株中taxadiene产量比B株高2.5倍', '在酵母中单独表达TXS产量不足，通过组合表达Sulfolobus acidocaldarius的GGPPS、截短HMGR和突变转录因子UPC2-1，taxadiene产量从0.2 mg/L提高到8.7 mg/L', '在拟南芥中表达TXS得到60 μg taxadiene/kg干重，但出现致死表型', '在番茄果实中表达TXS获得160 mg taxadiene/kg果实，但生长缓慢', '在人参中表达TXS得到9.1 μg taxadiene/g干重，无表型变化', '在本氏烟中通过抑制phytoene synthase基因表达，taxadiene产量达到约40 μg/g干重', '在苔藓Physcomitrella patens中表达TXS，taxadiene产量可达组织鲜重的0.05%，且不改变内源二萜水平', '紫杉醇从植物中提取量约为1 g/10 kg植物组织，2-4棵成熟树木的紫杉醇量不足以治疗一名患者']
研究结论
TXS是紫杉醇生物合成中的关键限速酶，通过代谢工程在大肠杆菌、酵母及多种植物中已实现了taxadiene的异源生产，其中大肠杆菌中产量已达克级水平。TXS晶体结构的解析为蛋白质工程提供了基础，未来结合理性设计与定向进化有望进一步提升TXS活性。真菌来源的TXS同源酶仍存在争议，但可能是发掘新催化元件的潜在方向。