高级醇 · 代谢工程文献库

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Efflux Transporter Engineering Markedly Improves Amorphadiene Production in Escherichia coli

作者
Congqiang Zhang, Xixian Chen, Gregory Stephanopoulos, Heng-Phon Too
单位
Chemical and Pharmaceutical Engineering, Singapore-MIT Alliance, 4 Engineering Drive 3, Singapore, Singapore; Biotransformation Innovation Platform (BioTrans), Agency for Science, Technology and Research (A*STAR), Singapore, Singapore; Department of Chemical Engineering, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, Massachusetts; Department of Biochemistry, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, 8 Medical Drive, Blk MD7, Level 4, Singapore 117597, Singapore
杂志
Biotechnology and Bioengineering（2016）
DOI
10.1002/bit.25943
所属领域
代谢工程
关键词
TolCamorphadieneartemisininefflux pumplipopolysaccharide transport systemtransporter engineering
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解决的核心问题

大肠杆菌中紫穗槐二烯（青蒿素前体）的生产受限于产物胞内积累，需要找到并工程化内源转运蛋白促进产物外排以提高产量。

研究策略

系统敲除16个内源多药外排转运蛋白基因，鉴定TolC为关键外排蛋白；随后过表达TolC及其相关外排系统（如MacAB、EmrAB等）和脂多糖（LPS）转运系统组分，并组合共表达以产生协同效应，从而显著提高紫穗槐二烯的产量。

研究路线图

100%
研究问题：青蒿素前体紫穗槐二烯在大肠杆菌中胞内积累，限制产量
策略：系统敲除16个内源多药外排转运蛋白基因
关键发现：TolC为关键外排蛋白
关键改造：过表达TolC及其相关外排系统
关键改造：过表达LPS转运系统组分
协同共表达：多种转运蛋白组合
结果：AD产量显著提高至25-29 mg/L/OD
结论：内源转运蛋白工程策略可推广至疏水化合物
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核心内容

该研究系统评估并工程化了大肠杆菌内源外排转运蛋白以提升紫穗槐二烯（青蒿素前体）的产量。作者逐一敲除16个内源多药外排转运蛋白基因，鉴定出TolC为关键外排蛋白——敲除tolC使胞内紫穗槐二烯特异性产量增加8.2倍而胞外产量降低90%，回补后胞外产量恢复至0.28 mg/L/OD。在此基础上过表达TolC及其关联的ABC和MFS家族转运蛋白系统（如MacAB、EmrAB、EmrKY），8小时产量从5.1提高到约20.8 mg/L/OD；过表达脂多糖转运系统组分lptCABFG或msbA亦可提高产量逾2倍。共表达msbA与tolC产生协同效应，产量达20.3 mg/L/OD，优于单独表达任一者，最终最高产量达到25–29 mg/L/OD。该工作首次证明TolC介导紫穗槐二烯外排，并揭示LPS转运系统参与疏水化合物分泌，表明内源转运蛋白的合理组合工程化可成为提高微生物生产疏水萜类化合物产量的通用策略。

创新点

1. 系统评估内源转运蛋白而非异源表达；2. 首次证明TolC介导紫穗槐二烯外排；3. 发现ABC和MFS家族转运蛋白与TolC组合过表达可提高产量超过3倍；4. 发现LPS转运系统参与疏水化合物外排；5. 多种转运蛋白共表达具有协同效应。

研究对象（25）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
Escherichia coli MEP途径 (紫穗槐二烯生物合成) ADS Amorphadiene synthase 催化 催化FPP生成紫穗槐二烯，在pACM-ADS或pACM-SAAI中表达
Escherichia coli MEP途径 dxs 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase 催化 过表达增强MEP通量
Escherichia coli MEP途径 idi Isopentenyl diphosphate isomerase 催化 过表达增强MEP通量
Escherichia coli MEP途径 ispDF IspD/IspF (MEP cytidylyltransferase and cyclodiphosphate synthase) 催化 过表达增强MEP通量
Escherichia coli 紫穗槐二烯外排 tolC TolC 转运 外膜蛋白，单基因敲除使胞内AD增加8.2倍，过表达提高AD产量2倍以上；在BW25113和MG1655中研究
Escherichia coli 紫穗槐二烯外排 macAB MacAB 转运 ABC家族，与TolC形成复合物，过表达显著提高AD产量
Escherichia coli 紫穗槐二烯外排 acrAB AcrAB 转运 RND家族，过表达提高AD产量；敲除筛选分别敲除acrA和acrB
Escherichia coli 紫穗槐二烯外排 emrAB EmrAB 转运 MFS家族，与TolC共表达，8h AD产量从5.1增至20.8 mg/L/OD
Escherichia coli 紫穗槐二烯外排 acrEF AcrEF 转运 RND家族，过表达提高AD产量
Escherichia coli 紫穗槐二烯外排 emrKY EmrKY 转运 MFS家族，与TolC共表达显著提高产量；包含emrK
Escherichia coli 紫穗槐二烯外排 entS EntS 转运 MFS家族，与TolC共表达无显著效果
Escherichia coli 紫穗槐二烯外排 acrD AcrD 转运 RND家族，在敲除筛选和过表达中均研究
Escherichia coli 紫穗槐二烯外排 mdtEF MdtEF 转运 RND家族，包含mdtE和mdtF，过表达提高AD产量
Escherichia coli 紫穗槐二烯外排 / LPS转运 msbA MsbA 转运 LPS翻转酶，过表达使AD产量提高2倍以上；与TolC共表达协同
Escherichia coli LPS转运 lptD LptD 转运 外膜蛋白，过表达轻微提高AD产量
Escherichia coli LPS转运 lptCABFG LptCABFG 转运 ABC转运系统，过表达提高AD产量2倍以上
Escherichia coli 紫穗槐二烯外排 bcr Bcr 转运 MFS家族，单基因敲除筛选，对AD外排无显著影响
Escherichia coli 紫穗槐二烯外排 cmr Cmr 转运 MFS家族，单基因敲除筛选，对AD外排无显著影响
Escherichia coli 紫穗槐二烯外排 emrD EmrD 转运 MFS家族，单基因敲除筛选，对AD外排无显著影响
Escherichia coli 紫穗槐二烯外排 fsr Fsr 转运 MFS家族，单基因敲除筛选，对AD外排无显著影响
Escherichia coli 紫穗槐二烯外排 mdtL MdtL 转运 MFS家族，单基因敲除筛选，对AD外排无显著影响
Escherichia coli 紫穗槐二烯外排 mdtA MdtA 转运 RND家族，单基因敲除筛选，对AD外排无显著影响；mdtABC系统构建未成功
Escherichia coli 紫穗槐二烯外排 cusC CusC 转运 RND家族，单基因敲除筛选，对AD外排无显著影响
Escherichia coli 紫穗槐二烯外排 mdtJ MdtJ 转运 SMR家族，单基因敲除筛选，对AD外排无显著影响
Escherichia coli 紫穗槐二烯外排 mdtK MdtK 转运 MATE家族，单基因敲除筛选，对AD外排无显著影响

关键发现

  1. 敲除tolC导致胞内紫穗槐二烯特异性产量增加8.2倍，胞外产量降低90%
  2. 回补tolC后胞外特异性产量从0.15 mg/L/OD恢复至0.28 mg/L/OD。过表达emrAB-tolC、emrKY-tolC或macAB-tolC使AD产量在8小时从5.1 mg/L/OD提高至约20.8 mg/L/OD，在24小时从5.8提高至约22.4 mg/L/OD。过表达lptCABFG或msbA使AD产量提高超过2倍。共表达msbA和tolC的AD特异性产量达20.3 mg/L/OD，高于单独表达tolC（16.1）或msbA（16.2）。最高AD产量达到25-29 mg/L/OD。

研究结论

通过筛选并合理工程化大肠杆菌内源转运蛋白，特别是TolC依赖性外排系统和LPS转运系统，可显著提高紫穗槐二烯的产量。这种策略可推广至其他疏水化合物的生产。