Triterpene Hydrocarbon Production Engineered Into a Metabolically Versatile Host—Rhodobacter capsulatus
- 作者
- Nymul E. Khan, S. Eric Nybo, Joe Chappell, Wayne R. Curtis
- 单位
- Department of Chemical Engineering, The Pennsylvania State University; Department of Pharmaceutical Sciences, University of Kentucky
- 杂志
- Biotechnology and Bioengineering（2015）
- DOI
- 10.1002/bit.25573
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
探索在不依赖糖作为碳源的条件下，利用多种营养模式（异养、光异养、化能自养）生产高能三萜烃（botryococcene和squalene）的可行性，以Rhodobacter capsulatus为宿主。
研究策略
将来自Botryococcus braunii的botryococcene合酶（BS）或squalene合酶（SS）基因，与增强MEP通路的dxs、idi及fps基因构建成多顺反子表达载体，导入R. capsulatus中，并比较不同营养模式下的产量；进一步通过补料分批和连续生物反应器优化生产力。
研究路线图
核心内容
该研究以紫色非硫细菌荚膜红杆菌为宿主，首次实现了三萜烃类化合物（botryococcene和squalene）的异源生产，探索了不依赖糖类碳源的替代生产路线。研究者将来自布朗葡萄藻的botryococcene合酶或squalene合酶基因与增强MEP通路的dxs、idi和fps基因构建成多顺反子表达载体导入宿主，并比较了好氧异养、厌氧光异养和好氧化能自养三种营养模式下的产量。结果显示，三种模式下两种产物的产量均约为5 mg/gDW，其中squalene产量为botryococcene的两倍；在添加fps基础上引入dxs和idi使产量提高20至100倍。在生物反应器实验中，葡萄糖补料分批培养的botryococcene产量达40 mg/L，而自养分批和连续培养分别达到110 mg/L和60 mg/L，连续自养操作比生产力达0.32 mg/gDW/h。研究表明荚膜红杆菌能利用光或氢气与二氧化碳等多种能源和碳源生产三萜烃且产量与糖基路线相当，为可持续生物燃料生产提供了新思路。
创新点
首次在紫色非硫细菌R. capsulatus中实现三萜烃的异源生产；证明同一宿主可通过多种营养模式（碳水化合物、光、氢气+CO2）达到相近的产量；实现了化能自养条件下的连续生产并获得较高比生产力。
研究对象（10）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli DH5α | MEP pathway | dxs | 1-Deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase | 催化 | 用于构建测试，增强MEP通量 |
| Escherichia coli DH5α | MEP pathway | idi | isopentenyl diphosphate isomerase | 催化 | 用于构建测试，调节IPP/DMAPP比例 |
| Escherichia coli DH5α | 萜类合成 | fps | farnesyl diphosphate synthase | 催化 | 用于构建测试，合成FPP前体 |
| Escherichia coli DH5α | 三萜合成 | BS | botryococcene synthase | 催化 | 嵌合酶，催化FPP转化为botryococcene |
| Escherichia coli DH5α | 三萜合成 | SS | squalene synthase | 催化 | 来自B. braunii，催化FPP转化为squalene |
| Rhodobacter capsulatus SB1003 | MEP pathway | dxs | 1-Deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase | 催化 | 增强MEP通量，提高三萜产量 |
| Rhodobacter capsulatus SB1003 | MEP pathway | idi | isopentenyl diphosphate isomerase | 催化 | 增强MEP通量，平衡IPP与DMAPP |
| Rhodobacter capsulatus SB1003 | 萜类合成 | fps | farnesyl diphosphate synthase | 催化 | 促进FPP合成，解除通量限制 |
| Rhodobacter capsulatus SB1003 | 三萜合成 | BS | botryococcene synthase | 催化 | 目标产物botryococcene合成酶 |
| Rhodobacter capsulatus SB1003 | 三萜合成 | SS | squalene synthase | 催化 | 目标产物squalene合成酶 |
关键发现
- 在小型培养中，好氧异养、厌氧光异养和好氧化能自养三种模式下，botryococcene或squalene产量均约为5 mg/gDW
- squalene产量是botryococcene的两倍。葡萄糖补料分批反应器中botryococcene产量达40 mg/L（约12 mg/gDW），OD660达12.7
- 自养分批反应器产量达110 mg/L（16.7 mg/gDW），OD660约17
- 连续自养操作产量为60 mg/L（23 mg/gDW），稀释率为9.62×10^-3 h^-1（约为μmax 0.112 h^-1的10%）。批式和连续自养比生产力分别达0.5和0.32 mg/gDW/h。添加fps后产量提高，再引入dxs和idi使产量提高20-100倍，补充80 mM葡萄糖进一步使产量提高1.5-2倍。
研究结论
R. capsulatus能够利用多种能源和碳源（糖、光、氢气+CO2）生产三萜烃，且各营养模式的产量相近，表明不依赖糖的替代原料路线可行。自养连续操作可获得与异养相当甚至更高的比生产力，为可持续生物燃料生产提供了新思路。