Selective Retinol Production by Modulating the Composition of Retinoids From Metabolically Engineered E. coli
- 作者
- Hui-Jeong Jang, Bo-Kyung Ha, Jia Zhou, Jiyoon Ahn, Sang-Hwal Yoon, Seon-Won Kim
- 单位
- Division of Applied Life Science (BK21 Plus), PMBBRC, Gyeongsang National University; Life Science Research Institute, Daewoong Pharmaceutical Corporation; Department of Biochemistry, University of Cambridge
- 杂志
- Biotechnology and Bioengineering（2015）
- DOI
- 10.1002/bit.25577
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
大肠杆菌没有内在的维甲类代谢途径，但在引入β-胡萝卜素合成途径和BCMO基因后，除视黄醛外还会产生视黄醇和乙酸视黄酯；本研究的核心问题是鉴定催化这些副产物生成的酶，并实现维甲类组成的人为调控，特别是选择性生产视黄醇。
研究策略
通过同源比对搜索大肠杆菌内源候选基因（eutE、puuC、ybbO），采用基因敲除和过表达验证其功能；同时发现质粒上的cat基因（氯霉素乙酰转移酶）负责视黄醇的乙酰化，通过将cat替换为卡那霉素抗性基因并过表达ybbO，实现视黄醇比例的提高。
核心内容
本研究针对代谢工程大肠杆菌中维甲类产物组成不可控的问题，系统鉴定了催化副产物生成的酶并实现视黄醇的选择性高产。通过同源比对，从大肠杆菌内源基因中筛选出候选氧化还原酶基因ybbO，并通过基因敲除和过表达实验证实其编码的酶可将视黄醛还原为视黄醇。同时意外发现质粒上的氯霉素抗性基因cat编码的乙酰转移酶能非特异性催化视黄醇生成乙酸视黄酯，通过将cat替换为卡那霉素抗性基因可基本消除该副产物。在组合过表达ybbO并去除cat基因的优化菌株中，总维甲类产量为87 mg/L，其中视黄醇达76 mg/L，在总维甲类中占比高达88%，而野生型菌株中视黄醇比例仅为40%。这一发现首次阐明了大肠杆菌内源ybbO和载体抗性基因在维甲类代谢中的非预期功能，提供了通过酶鉴定和组合调控实现产物选择性合成的策略，为利用大肠杆菌工业化生产视黄醇这一化妆品重要成分奠定了基础。
创新点
首次鉴定出大肠杆菌内源ybbO基因编码的氧化还原酶可将视黄醛还原为视黄醇；发现质粒上氯霉素抗性基因cat编码的氯霉素乙酰转移酶可非特异性催化视黄醇生成乙酸视黄酯；通过组合操作ybbO过表达和cat基因缺失，将视黄醇在总维甲类中的比例提高到88%。
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli DH5α | 维甲类转化（视黄醛还原为视黄醇） | ybbO | YbbO（预测的氧化还原酶） | 催化 | 鉴定为视黄醛还原酶，负责将视黄醛还原为视黄醇；过表达可显著提高视黄醇比例。 |
| Escherichia coli DH5α | 维甲类转化（视黄醇乙酰化为乙酸视黄酯） | cat | 氯霉素乙酰转移酶 | 催化 | 质粒pSTV28上的氯霉素抗性基因，非特异性催化视黄醇生成乙酸视黄酯；去除后乙酸视黄酯产量大幅下降。 |
| Escherichia coli DH5α | β-胡萝卜素裂解为视黄醛 | bbl（SR） | β-胡萝卜素15,15'-单加氧酶（BCMO） | 催化 | 来自未培养海洋细菌66A03的密码子优化基因，催化β-胡萝卜素裂解为视黄醛。 |
| Escherichia coli DH5α | 视黄醛氧化（推测） | eutE | EutE（预测的醛脱氢酶/乙醇胺利用蛋白） | 催化 | 与沙门氏菌视黄醛脱氢酶有97%相似性，但实验证明其敲除或过表达对维甲类产量和组成无影响。 |
| Escherichia coli DH5α | 视黄醛氧化（推测） | puuC | PuuC（γ-谷氨酰-γ-氨基丁醛脱氢酶） | 催化 | 与人视黄醛脱氢酶有63%相似性，但实验证明其敲除或过表达对维甲类产量和组成无影响。 |
| Escherichia coli DH5α | 甲羟戊酸途径（外源MVA途径） | mvaE, mvaS, mvaK1, mvaK2, mvaD, idi | MvaE, MvaS, MvaK1, MvaK2, MvaD, IPP异构酶 | 催化 | 来自粪肠球菌（mvaE, mvaS）和肺炎链球菌（mvaK1, mvaK2, mvaD）的完整MVA途径基因，以及大肠杆菌idi，用于供给异戊烯基焦磷酸（IPP）和二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP）前体。 |
| Escherichia coli DH5α | β-胡萝卜素生物合成途径 | crtE, crtB, crtI, crtY, ipiHP1, dxs | CrtE, CrtB, CrtI, CrtY, IPI, Dxs | 催化 | 包括来自成团泛菌的crtE/crtB/crtI、菠萝泛菌的crtY，以及雨生红球藻的ipiHP1和大肠杆菌dxs，用于合成β-胡萝卜素。 |
关键发现
- 野生型菌株（pT-DHBSR/pS-NA）总维甲类产量为140 mg/L，其中视黄醛、视黄醇、乙酸视黄酯分别为70、56、14 mg/L（50%:40%:10%）。敲除ybbO后总产量降至125 mg/L，视黄醛与视黄醇分别为80和34 mg/L（比例64%:27%:9%）。过表达ybbO后，视黄醛降至21 mg/L，视黄醇增至67 mg/L（比例53%，为野生型38%的1.4倍），乙酸视黄酯为38 mg/L。将pS-NA中cat基因替换为卡那霉素抗性基因（pS-NAK）后，乙酸视黄酯产量从14 mg/L降至1 mg/L，视黄醇和视黄醛基本不变。使用pT-DHBSRybbO/pS-NA时，总产量109 mg/L，视黄醛7 mg/L、视黄醇78 mg/L、乙酸视黄酯24 mg/L（比例6%:72%:22%）
- 使用pT-DHBSRybbO/pS-NAK时，总产量87 mg/L，视黄醛5 mg/L、视黄醇76 mg/L、乙酸视黄酯5 mg/L，视黄醇比例高达88%。
研究结论
通过代谢工程手段，即过表达ybbO基因并去除cat基因，可以显著改变维甲类产物组成，实现视黄醇的选择性高产（比例达88%），为工业上利用大肠杆菌生产视黄醇（化妆品成分）提供了可行方法。