Coupling limonene formation and oxyfunctionalization by mixed-culture resting cell fermentation
- 作者
- Christian Willrodt, Anna Hoschek, Bruno Bühler, Andreas Schmid, Mattijs K. Julsing
- 单位
- Laboratory of Chemical Biotechnology, Department of Biochemical and Chemical Engineering, TU Dortmund University, Dortmund, Germany; Department Solar Materials, Helmholtz Centre for Environmental Research (UFZ), Leipzig, Germany
- 杂志
- Biotechnology and Bioengineering（2015）
- DOI
- 10.1002/bit.25592
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
解决有毒、挥发性和低溶解度中间体/产物在微生物全细胞合成中的挑战，特别是葡萄糖合成紫苏醇乙酸酯(perillyl acetate)过程中，柠檬烯(limonene)的挥发和原位萃取导致其难以被氧化功能化的问题。
研究策略
采用混合培养静止细胞发酵策略，将柠檬烯生物合成与氧化功能化分别置于两个不同的重组大肠杆菌菌株中，通过调整细胞比例调控反应速率；同时优化P450基因表达、构建LS-CYP153A6融合蛋白提高空间邻近性，并评估CymA作为替代羟化酶。
研究路线图
核心内容
针对葡萄糖合成紫苏醇乙酸酯（POHAc）过程中，柠檬烯中间体挥发及原位萃取导致的氧化功能化受限问题，本研究提出混合培养静止细胞发酵策略。将柠檬烯合成与氧化功能化分别置于两个重组大肠杆菌菌株中，通过调控细胞比例匹配反应速率，并评估P450表达优化、LS-CYP153A6融合蛋白及CymA替代羟化酶的效果。关键结果显示，混合菌群静止细胞发酵使POHAc浓度较单菌株双液相发酵提高3.3倍，达21.7 mg/L（约125 μmol/L），平均生产率为7.34 mg L⁻¹ h⁻¹，远高于双液相分批培养的0.21 mg L⁻¹ h⁻¹；而含CYP153A6的单菌株静止细胞发酵仅得1.8 mg/L。LS-CYP153A6融合虽使柠檬烯/POHAc摩尔比从3.2降至1.6，但融合蛋白表达下降导致总产量降低；CymA在混合菌群中表现更优，10:1细胞比例时POHAc生成速率达0.11 U/g_cdw。该策略通过空间分离合成与转化步骤有效规避有毒挥发性中间体限制，可推广至其他涉及不稳定中间体的级联反应。
创新点
['开发了混合菌群静止细胞发酵新概念，空间分离柠檬烯合成与氧化功能化，避免中间体挥发/萃取问题。', '通过LS-CYP153A6翻译融合将柠檬烯合成与羟化反应偶联，使柠檬烯/POHAc摩尔比从3.2降至1.6。', '利用CymA替代CYP153A6，在混合菌群中实现更高的POHAc生成速率。']
研究对象（8）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| E. coli BL21(DE3) | 异源甲羟戊酸(MVA)途径与柠檬烯合成途径 | LS (limonene synthase) | 柠檬烯合成酶 | 催化 | 催化GPP环化生成(S)-柠檬烯，来自M. spicata，截短并密码子优化。 |
| E. coli BL21(DE3) | 异源甲羟戊酸(MVA)途径与柠檬烯合成途径 | AGPPS2 | 牻牛儿基焦磷酸合酶 | 催化 | 催化IPP和DMAPP缩合生成GPP，来自A. grandis。 |
| E. coli MG1655 | 柠檬烯氧化功能化途径 | CYP153A6 | 细胞色素P450单加氧酶153A6 | 催化 | 区域选择性羟化柠檬烯生成紫苏醇(POH)，来自Mycobacterium sp. HXN1500。 |
| E. coli MG1655 | 柠檬烯氧化功能化途径 | FdR, FdX | 铁氧还蛋白还原酶和铁氧还蛋白 | 能量供给 | 为CYP153A6提供电子传递。 |
| E. coli MG1655 | 柠檬烯氧化功能化途径 | cymAa, cymAb | 对伞花烃单加氧酶CymA | 催化 | 来自P. putida GS1，可替代CYP153A6羟化柠檬烯，生成POH和紫苏醛混合产物。 |
| E. coli MG1655 | 紫苏醇乙酰化途径 | cat (chloramphenicol acetyltransferase) | 氯霉素乙酰转移酶 | 催化 | 将紫苏醇(POH)乙酰化为紫苏醇乙酸酯(POHAc)，位于pMVAidi质粒上。 |
| E. coli (pCom8:PFR1500L) | 底物摄取途径 | alkL | 外膜蛋白AlkL | 转运 | 增强疏水底物柠檬烯的跨膜摄取，提高羟化效率。 |
| E. coli MG1655 | 柠檬烯合成与氧化功能化偶联途径 | LS-CYP153A6 fusion | 柠檬烯合成酶-CYP153A6融合蛋白 | 催化 | 通过柔性linker (GGGGGGA)连接LS和CYP153A6，实现空间邻近，使柠檬烯/POHAc摩尔比从3.2降至1.6。 |
关键发现
- ['优化P450基因表达后，双液相分批培养中POHAc产量达到6.20 ±
- 06 mg/g_cdw，葡萄糖得率为0.68 ±
- 03 mg/g_glucose。', '混合菌群静止细胞发酵使POHAc浓度提高3.3倍，达到21.7 mg/L（约125 μmol/L），相比单菌株双液相发酵。', '使用CYP153A6和CymA的混合菌群POHAc生成速率分别为0.06和0.11 U/g_cdw。', '含CYP153A6的E. coli MG1655单菌株静止细胞发酵最终POHAc浓度仅1.8 ±
- 3 mg/L，而混合菌群达到21.7 ±
- 0 mg/L。', '混合菌群平均生产率为7.34 ±
- 68 mg L⁻¹ h⁻¹，远高于双液相分批培养的≥0.21 mg L⁻¹ h⁻¹。', 'LS-CYP153A6融合使柠檬烯/POHAc摩尔比从3.2降至1.6，但融合蛋白表达量下降导致总POHAc产量降低。', 'CymA在混合菌群中表现优于CYP153A6，10:1细胞比例时POHAc生成速率更高。']
研究结论
混合培养静止细胞发酵是一种有效的策略，能够利用不同底盘细胞分别执行合成和氧化功能化反应，克服有毒/挥发性中间体带来的限制，实现从葡萄糖到POHAc的高效合成。该概念可推广至其他涉及不稳定中间体的级联反应，并与代谢工程手段互补结合。