Photoautotrophic production of macular pigment in a Chlamydomonas reinhardtii strain generated by using DNA-free CRISPR-Cas9 RNP-mediated mutagenesis
- 作者
- Kwangryul Baek, Jihyeon Yu, Jooyeon Jeong, Sang Jun Sim, Sangsu Bae, EonSeon Jin
- 单位
- Department of Life Science, Hanyang University, Seoul, South Korea; School of Biological Sciences, Seoul National University, Seoul, South Korea; Department of Chemical and Biological Engineering, Korea University, Seoul, South Korea; Department of Chemistry, Hanyang University, Seoul, South Korea
- 杂志
- Biotechnology and Bioengineering（2017）
- DOI
- 10.1002/bit.26499
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
野生型莱茵衣藻在非胁迫条件下玉米黄质含量极低，难以满足黄斑色素工业化生产需求；同时需要开发非转基因的遗传改造方法。
研究策略
从七个实验室菌株中筛选出生长最快、生物量最高的CC-4349菌株，利用DNA-free CRISPR-Cas9核糖核蛋白（RNP）直接递送敲除玉米黄质环氧化酶（ZEP）基因，阻断玉米黄质向紫黄质转化，从而在光自养条件下实现叶黄素与玉米黄质的同时积累；并将突变体藻粉作为蛋鸡饲料添加剂，生产富含黄斑色素的鸡蛋。
核心内容
本研究以莱茵衣藻为底盘，旨在解决野生型菌株在非胁迫条件下玉米黄质含量极低、难以工业化生产黄斑色素的问题。作者首先从七个实验室菌株中筛选出生长最快、生物量最高的CC-4349作为宿主，其比生长速率达0.12 h⁻¹、最高生物量1.26 g/L。随后采用DNA-free CRISPR-Cas9核糖核蛋白（RNP）直接递送的方式敲除玉米黄质环氧化酶（ZEP）基因，阻断玉米黄质向紫黄质的转化，实现光自养条件下叶黄素与玉米黄质的同时积累。所得ΔZEP突变体中玉米黄质含量平均为2.26 mg/L，较野生型的0.05 mg/L提高56倍，生产力提高47倍，且叶黄素含量与野生型相当。将0.3%突变体藻粉饲喂蛋鸡后，蛋黄中叶黄素浓度达25.48 μg/mL、玉米黄质达25.63 μg/mL，分别是对照组的2.0倍和2.2倍。该研究证实了无外源DNA整合的基因敲除策略在藻类代谢工程中的可行性，为黄斑色素的非转基因商业化生产提供了新途径，并拓展了微藻作为功能性饲料添加剂的应用潜力。
创新点
首次系统评价莱茵衣藻光自养条件下的类胡萝卜素生产能力；采用DNA-free CRISPR-Cas9 RNP技术实现无外源DNA整合的基因敲除，降低脱靶效应且可能豁免GMO监管；所得突变体玉米黄质含量提高56倍，且叶黄素水平不降低；成功开发出富含叶黄素和玉米黄质的鸡蛋。
研究对象（1）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Chlamydomonas reinhardtii CC-4349 | 类胡萝卜素生物合成 | ZEP（zeaxanthin epoxidase gene） | Zeaxanthin epoxidase（玉米黄质环氧化酶） | 催化 | 敲除该基因阻断玉米黄质向紫黄质转化，使突变体组成型积累玉米黄质 |
关键发现
- 筛选出CC-4349为最佳产类胡萝卜素菌株，其比生长速率0.12 h^-1，最高生物量1.26 g/L，生物量生产力0.84 g/L/d。ZEP敲除突变体（ΔZEP）在光自养条件下玉米黄质含量平均2.26 mg/L（野生型仅0.05 mg/L），提高56倍
- 玉米黄质生产力提高47倍
- 叶黄素含量与野生型相当（如ΔZEP1叶黄素含量3.08 mg/g）。高光下ΔZEP突变体玉米黄质达365.95 mmol/mol叶绿素，低光下达264.48 mmol/mol。蛋鸡饲喂0.3%突变体藻粉后，蛋黄中叶黄素浓度25.48 μg/mL、玉米黄质25.63 μg/mL，分别是对照组（12.49、11.65 μg/mL）的2.0和2.2倍。
研究结论
莱茵衣藻CC-4349菌株经DNA-free CRISPR-Cas9 RNP敲除ZEP基因后，可在光自养条件下高效积累玉米黄质且不减少叶黄素，作为饲料添加剂可生产黄斑色素强化鸡蛋，具有商业化应用潜力，该技术路线在藻类生物技术中具有广泛适用性。