Consolidated bioprocessing of starchy substrates into ethanol by industrial Saccharomyces cerevisiae strains secreting fungal amylases
- 作者
- L Favaro, MJ Viktor, SH Rose, M Viljoen-Bloom, WH van Zyl, M Basaglia, L Cagnin, S Casella
- 单位
- Department of Agronomy Food Natural resources Animals and Environment (DAFNAE) Università di Padova, Agripolis, Viale dell'Università 16, 35020 Legnaro (PD), Italy; Department of Microbiology, Stellenbosch University, Private Bag X1, 7602 Matieland, Stellenbosch, South Africa.
- 杂志
- Biotechnology and Bioengineering（2015）
- DOI
- 10.1002/bit.25591
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
工业酿酒酵母缺乏淀粉水解酶，导致淀粉基乙醇生产需要高能耗液化和外源淀粉酶，生产成本高；需要开发能够一步完成生淀粉水解和乙醇发酵的工业菌株（CBP），以降低成本和简化工艺。
研究策略
将来自Thermomyces lanuginosus的葡糖淀粉酶基因TLG1和来自Saccharomyces fibuligera的α-淀粉酶基因SFA1进行密码子优化，通过δ-整合（delta-integration）整合到两个具有优良工业特性的酿酒酵母菌株M2n和MEL2基因组中，使重组菌株共分泌两种淀粉酶，实现生淀粉的水解和同步发酵。
研究路线图
核心内容
该研究针对工业酿酒酵母缺乏淀粉水解酶、导致淀粉基乙醇生产依赖高能耗液化和外源酶的问题，构建了可直接利用生淀粉发酵产乙醇的联合生物加工菌株。研究者将来自Thermomyces lanuginosus的葡糖淀粉酶基因TLG1和来自Saccharomyces fibuligera的α-淀粉酶基因SFA1进行密码子优化后，通过δ-整合导入工业菌株M2n和MEL2基因组，实现两种淀粉酶的共分泌和稳定表达。重组菌株在可溶性淀粉和生淀粉上均表现出高酶活，其中M2n[TLG1-SFA1]的总淀粉酶活最高达8118 nkat/g DCW。在含200 g/L生玉米淀粉的1 L生物反应器中，该菌株产生64.00 g/L乙醇，达到理论得率的55%；在天然高粱和黑小麦底物上，无需预处理和外加酶即分别获得50.67 g/L和51.48 g/L乙醇，对应理论得率的62%和73%，碳转化率分别达85%和99%，黑小麦上最大体积产率达1.04 g/L/h。该研究首次在工业菌株中实现两种淀粉酶的共分泌，验证了以天然淀粉质原料直接进行纤维素乙醇式联合生物加工的可行性，M2n[TLG1-SFA1]为淀粉基乙醇CBP工艺的进一步开发提供了优良候选菌株。
创新点
首次在工业酿酒酵母菌株中共分泌葡糖淀粉酶和α-淀粉酶；采用密码子优化的TLG1和SFA1基因并通过δ-整合实现多拷贝稳定表达；在生物反应器规模上验证了无需预处理和外加酶的天然含淀粉底物（玉米、高粱、黑小麦）的直接乙醇生产。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae M2n | 淀粉水解 | TLG1 | TLG1葡糖淀粉酶 | 催化 | 密码子优化的Thermomyces lanuginosus葡糖淀粉酶，δ-整合，分泌表达 |
| Saccharomyces cerevisiae M2n | 淀粉水解 | SFA1 | SFA1 α-淀粉酶 | 催化 | 密码子优化的Saccharomyces fibuligera α-淀粉酶，δ-整合，分泌表达 |
| Saccharomyces cerevisiae MEL2 | 淀粉水解 | TLG1 | TLG1葡糖淀粉酶 | 催化 | 密码子优化的Thermomyces lanuginosus葡糖淀粉酶，δ-整合，分泌表达 |
| Saccharomyces cerevisiae MEL2 | 淀粉水解 | SFA1 | SFA1 α-淀粉酶 | 催化 | 密码子优化的Saccharomyces fibuligera α-淀粉酶，δ-整合，分泌表达 |
关键发现
- 重组菌株M2n[TLG1-SFA1]和MEL2[TLG1-SFA1]在可溶性淀粉和生淀粉上表现高酶活，最高总淀粉酶活分别达8118和4461 nkat/g DCW（可溶性淀粉60°C）及7125和3883 nkat/g DCW（MEL2）
- 在200 g/L生玉米淀粉的1 L生物反应器中，M2n[TLG1-SFA1]和MEL2[TLG1-SFA1]分别产生64.00 g/L和52.43 g/L乙醇，分别达到理论得率的55%和45%
- 在天然高粱和黑小麦底物上，M2n[TLG1-SFA1]的乙醇产量分别达到50.67 g/L（120h）和51.48 g/L（240h），对应理论得率的62%和73%，碳转化率分别为85%和99%
- M2n[TLG1-SFA1]在黑小麦上最大体积产率Qmax达1.04 g/L/h（24h），高粱上为0.78 g/L/h，玉米上为0.59 g/L/h
- MEL2[TLG1-SFA1]在相应底物上的Qmax分别为0.58、0.46和0.30 g/L/h。
研究结论
本研究首次报道了工业酿酒酵母菌株共分泌葡糖淀粉酶和α-淀粉酶，在无预处理和外加酶的条件下，于生物反应器规模直接从天然含淀粉底物（玉米、高粱、黑小麦）高效生产乙醇，验证了CBP的可行性。M2n[TLG1-SFA1]菌株具有最高的淀粉转化效率和乙醇产量，可作为进一步开发淀粉基生物乙醇CBP工艺的优良候选菌株。