Optimization of a Cytochrome P450 Oxidation System for Enhancing Protopanaxadiol Production in Saccharomyces cerevisiae
- 作者
- Fanglong Zhao, Peng Bai, Ting Liu, Dashiui Li, Xiangmei Zhang, Wenyu Lu, Yingjin Yuan
- 单位
- School of Chemical Engineering and Technology, Tianjin University, Tianjin 300072, PR China; Key Laboratory of System Bioengineering (Tianjin University), Ministry of Education, Tianjin, PR China; SynBio Research Platform, Collaborative Innovation Center of Chemical Science and Engineering (Tianjin), Tianjin, PR China
- 杂志
- Biotechnology and Bioengineering（2017）
- DOI
- 10.1002/bit.25934
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
细胞色素P450酶PPDS在酿酒酵母中异源表达活性低、PPDS与ATR1偶联效率差导致ROS积累并影响细胞生长，从而限制了原人参二醇的高效生产。
研究策略
通过跨膜结构域截短和构建自给自足的PPDS-ATR1融合蛋白（self-sufficient P450），优化P450氧化系统，并调控融合蛋白的整合拷贝数以提高原人参二醇产量。
核心内容
该研究针对酿酒酵母中细胞色素P450酶PPDS异源表达活性低、与还原酶ATR1偶联效率差而导致活性氧积累并抑制细胞生长的问题，通过构建自给自足的PPDS-ATR1融合蛋白来优化P450氧化系统。研究发现，保留跨膜结构域对融合蛋白在酵母中的催化活性至关重要，而linker长度影响不显著。融合蛋白的催化活性较PPDS与ATR1共表达提高约4.5倍，偶联效率从22.3%提升至29.6%，且活性氧水平虽略升高但未抑制细胞生长。将融合蛋白整合至3拷贝后，菌株W3a在摇瓶中获得265.7 mg/L原人参二醇，达玛烯二醇-II转化率达96.8%；在5 L生物反应器补料分批发酵中产量进一步提升至1436.6 mg/L，约98.8%的底物被转化。该策略通过改善P450酶与还原酶的物理邻近性，有效解决了电子传递效率低和活性氧毒性的瓶颈，为植物细胞色素P450在酵母中高效应用提供了通用方案。
创新点
['首次在酿酒酵母中构建植物自给自足P450融合蛋白PPDS-ATR1，融合酶催化活性较共表达提高约4.5倍。', '系统研究了跨膜结构域和linker长度对融合蛋白活性的影响，发现跨膜结构域对酵母中融合PPDS的催化活性至关重要，而linker长度影响不显著。', '通过3拷贝融合蛋白实现96.8%的达玛烯二醇-II转化率，5 L生物反应器补料分批发酵中原人参二醇产量达到1436.6 mg/L。']
研究对象（8）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae W303-1a | 三萜前体合成/原人参二醇生物合成 | DS | 达玛烯二醇-II合酶 | 催化 | 催化2,3-氧化鲨烯环化生成达玛烯二醇-II |
| Saccharomyces cerevisiae W303-1a | 原人参二醇生物合成 | PPDS | 原人参二醇合酶（CYP716A47） | 催化 | 催化达玛烯二醇-II C-12位羟基化生成原人参二醇 |
| Saccharomyces cerevisiae W303-1a | 细胞色素P450电子传递 | ATR1 | NADPH-细胞色素P450还原酶 | 能量供给 | 为PPDS提供NADPH来源的电子 |
| Saccharomyces cerevisiae W303-1a | 甲羟戊酸途径 | tHMG1 | 截短HMG-CoA还原酶 | 催化 | 过表达以增强甲羟戊酸前体供应 |
| Saccharomyces cerevisiae W303-1a | 甲羟戊酸途径/萜类合成 | ERG20 | 法尼基焦磷酸合酶 | 催化 | 催化IPP/DMAPP生成法尼基焦磷酸（FPP） |
| Saccharomyces cerevisiae W303-1a | 三萜骨架合成 | ERG9 | 鲨烯合酶 | 催化 | 催化两分子FPP生成鲨烯 |
| Saccharomyces cerevisiae W303-1a | 三萜前体合成 | ERG1 | 鲨烯环氧酶 | 催化 | 催化鲨烯生成2,3-氧化鲨烯 |
| Saccharomyces cerevisiae W303-1a | 原人参二醇生物合成 | PPDS-ATR1融合基因 | PPDS-ATR1自给自足融合蛋白 | 催化 | 由PPDS血红素域和截短ATR1还原酶域通过linker融合，催化活性提高约4.5倍 |
关键发现
- ['自给自足PPDS-ATR1融合蛋白的催化活性比PPDS与ATR1共表达提高约4.5倍，原人参二醇产量提高71.1%。', '携带PPDS-ATR1融合蛋白的菌株W3a在YPD培养基中产生265.7 mg/L原人参二醇和8.7 mg/L达玛烯二醇-II，达玛烯二醇-II转化率达96.8%。', '在5 L生物反应器补料分批发酵中，W3a的原人参二醇产量达到1436.6 mg/L，最终约98.8%达玛烯二醇-II被转化。', '摇瓶补料分批发酵中，W3a原人参二醇产量最高为1412.5 mg/L
- 不同linker融合蛋白菌株的产量为1367.5-1412.5 mg/L。', '共表达PPDS与ATR1的菌株W3产155.3 mg/L原人参二醇和96.5 mg/L达玛烯二醇-II
- 将PPDS和ATR1拷贝数增至5时（W3 plus）产量未提高（152.9 mg/L），且ROS水平升高至对照W2的4-5倍，细胞生长受到抑制。', '融合蛋白菌株的ROS水平为对照W2的2-3倍，但细胞生长未受影响
- 融合酶的偶联效率从共表达的22.3%提高至29.6%。', '跨膜结构域截短试验中，仅截短31个氨基酸的31tPPDS保留活性但低于天然PPDS，截短17、26、43个氨基酸均使PPDS失活
- 31tPPDS-ATR1融合蛋白无活性，表明跨膜结构域对酵母中融合PPDS的高效催化至关重要。', '不同linker（GSTSSGSSG、GSTSSG、GGG、无linker）对PPDS-ATR1融合蛋白的活性影响不显著。']
研究结论
通过保留跨膜结构域并构建自给自足的PPDS-ATR1融合蛋白，显著提高了酿酒酵母中原人参二醇的产量和达玛烯二醇-II的转化率，同时降低了ROS对细胞的毒性影响。该方法为植物细胞色素P450在酵母中的高效应用提供了通用策略。