Production of Farnesene and Santalene by Saccharomyces cerevisiae Using Fed-Batch Cultivations With RO-Controlled Feed
- 作者
- Stefan Tippmann, Gionata Scalcinati, Verena Siewers, Jens Nielsen
- 单位
- Department of Biology and Biological Engineering, Chalmers University of Technology; Novo Nordisk Foundation Center for Biosustainability, Chalmers University of Technology; Novo Nordisk Foundation Center for Biosustainability, Technical University of Denmark
- 杂志
- Biotechnology and Bioengineering（2016）
- DOI
- 10.1002/bit.25683
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
比较不同植物来源的法尼烯合酶在酿酒酵母中生产法尼烯的效率，并通过RQ控制的补料分批发酵提高法尼烯及檀香烯的产量。
研究策略
将来自苹果（M. domestica）、柚子（C. junos）和黄花蒿（A. annua）的三种法尼烯合酶基因在酿酒酵母中表达，结合截短HMG-CoA还原酶（tHMG1）过表达，利用两个已优化的产倍半萜平台菌株（SCICK16、SCIGS22），采用RQ控制的指数补料分批发酵进行生产，并与檀香烯生产进行对比。
研究路线图
核心内容
本研究在酿酒酵母中系统比较了三种植物来源的法尼烯合酶（苹果、柚子、黄花蒿）的生产效率，并结合截短HMG-CoA还原酶（tHMG1）过表达及呼吸商（RQ）控制的补料分批发酵策略提升倍半萜产量。摇瓶实验中，苹果源α-法尼烯合酶产量最高，约4 mg/L，较柚子和黄花蒿来源分别高17%和32%；共表达tHMG1后产量提升至少25%，达约6 mg/L。在RQ反馈控制的指数补料分批发酵中，利用优化菌株SCIST10获得最高法尼烯滴度168.75±4.68 mg/L，柚子和黄花蒿源分别为158.09和116.74 mg/L。檀香烯生产采用菌株SCIGS24，最终滴度达163 mg/L，但其生物量产率（0.006 g/gDCW）较法尼烯（约0.015 g/gDCW）降低超过50%。RQ控制在所有发酵中稳定维持在0.96–1.04，乙醇浓度接近零。结果表明，RQ控制策略能有效抑制副产物形成并显著提高法尼烯产量，三种合酶在优化菌株中整体效率差异不大，但檀香烯较低的生物量产率可能与其环化反应特性相关，为倍半萜工业化生产提供了工艺参考。
创新点
首次在工业相关补料分批工艺中系统比较多种植物来源的法尼烯合酶；应用RQ反馈控制实现葡萄糖限制并抑制乙醇形成；实现最高约170 mg/L法尼烯和163 mg/L檀香烯的产量。
研究对象（10）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-5D | 甲羟戊酸途径 | FarnSyn_Md | α-法尼烯合酶（来自苹果） | 催化 | 催化FPP转化为α-法尼烯，摇瓶最高产量4 mg/L |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-5D | 甲羟戊酸途径 | FarnSyn_Cj | β-法尼烯合酶（来自柚子） | 催化 | 催化FPP转化为β-法尼烯，同时生成副产物倍半萜烯 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-5D | 甲羟戊酸途径 | FarnSyn_Aa | β-法尼烯合酶（来自黄花蒿） | 催化 | 催化FPP转化为β-法尼烯，产品特异性高 |
| Saccharomyces cerevisiae 多种背景菌株 | 甲羟戊酸途径 | tHMG1 | 截短HMG-CoA还原酶 | 催化 | 过表达增强甲羟戊酸通量，提高法尼烯产量 |
| Saccharomyces cerevisiae SCICK16和SCIGS22 | 甾醇合成途径 | ERG9 | 鲨烯合酶 | 调控 | 通过PHXT1启动子下调，减少FPP向甾醇分支的消耗 |
| Saccharomyces cerevisiae SCIGS22 | 甲羟戊酸途径 | ERG20 | 法尼基焦磷酸合酶 | 催化 | 过表达以增强FPP前体供给 |
| Saccharomyces cerevisiae SCIGS22 | 辅因子代谢 | GDH2 | 谷氨酸脱氢酶 (NADPH依赖) | 能量供给 | 过表达以改善NADPH供给，维持辅因子平衡 |
| Saccharomyces cerevisiae SCIGS22 | 辅因子代谢 | GDH1 | 谷氨酸脱氢酶 | 能量供给 | 敲除以减少NADPH消耗，提高NADPH可用性 |
| Saccharomyces cerevisiae SCICK16和SCIGS22 | 脂质代谢 | LPP1、DPP1 | 脂质磷酸酶、二酰甘油焦磷酸磷酸酶 | 调控 | 敲除以避免FPP/GGPP的去磷酸化消耗，增加前体流向目标产物 |
| Saccharomyces cerevisiae SCIGS24 | 甲羟戊酸途径 | SanSyn | α-檀香烯合酶（来自Clausena lansium） | 催化 | 催化FPP转化为α-檀香烯，最终产量163 mg/L |
关键发现
- 摇瓶培养中，苹果α-法尼烯合酶产量最高，约4 mg/L，比柚子和黄花蒿来源的合酶分别高17%和32%
- 共表达tHMG1后产量提高至少25%，苹果源达约6 mg/L。在RQ控制的补料分批发酵中，利用优化菌株SCIST10（表达苹果α-法尼烯合酶）获得最高法尼烯滴度168.75±4.68 mg/L（约170 mg/L），SCIST11（柚子源）为158.09±8.13 mg/L，SCIST12（黄花蒿源）为116.74±30.26 mg/L。檀香烯生产使用菌株SCIGS24，最终滴度为163 mg/L
- 但檀香烯的生物量产率（Y_XFar）为0.006 g/gDCW，比法尼烯（在相同背景菌株下约0.015 g/gDCW）降低超过50%。RQ控制在所有发酵中平均维持在0.96-1.04，乙醇浓度基本维持在接近零的水平。
研究结论
RQ控制的指数补料策略成功用于评估不同植物来源的法尼烯合酶，并显著提高了法尼烯产量。三种合酶在优化菌株中的整体效率差异不显著，苹果源合酶略优；檀香烯产量与法尼烯接近，但其生物量产率明显更低，可能与其环化反应相关。