Co-production of acetone and ethanol with molar ratio control enables production of improved gasoline or jet fuel blends
- 作者
- Zachary C. Baer, Sebastian Bormann, Sanil Sreekumar, Adam Grippo, F. Dean Toste, Harvey W. Blanch, Douglas S. Clark
- 单位
- Energy Biosciences Institute, University of California, Berkeley; Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of California, Berkeley; Department of Chemistry, University of California, Berkeley; Chemical Sciences Division, Lawrence Berkeley National Laboratory
- 杂志
- Biotechnology and Bioengineering（2016）
- DOI
- 10.1002/bit.25978
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
乙醇作为汽油添加剂受限于混合比例（blend wall），无法高比例掺混；需要开发能生产更长链含氧燃料前体的方法，并解决微生物共生产丙酮和乙醇时比例不可控的问题。
研究策略
在大肠杆菌中构建不依赖乙酸/丁酸再吸收的合成丙酮途径（HMG-CoA合酶+裂解酶+硫解酶+乙酰乙酸脱羧酶），并与乙醇生产模块（AdhE或Pdc/AdhB）组合；通过选择不同来源的酶、敲除竞争途径（BFA7菌株）、改变碳源（葡萄糖 vs 葡萄糖酸）以及控制发酵通气量和pH，实现乙醇/丙酮摩尔比可调；最后用Pd/C催化烷基化将混合物升级为C5-C7酮类燃料调合组分。
研究路线图
核心内容
研究在大肠杆菌中构建了酸非依赖的合成丙酮途径，通过表达HMG-CoA合酶与裂解酶，将丙酮产量从0.14 g/L提升至5.1 g/L，提高超过35倍。通过组合不同来源的HMGS/HMGL与乙醇合成模块，并利用葡萄糖酸替代葡萄糖作为碳源以平衡还原当量，实现了乙醇/丙酮摩尔比在0.7:1至10:1范围内的可控调节。在750 mL生物反应器中，以葡萄糖酸为碳源时获得5.1 g/L丙酮和2.76 g/L乙醇，摩尔比达0.7:1；共表达运动发酵单胞菌pdc/adhB时乙醇产量达15.1 g/L。进一步以Pd/C催化烷基化将发酵产物升级为C5-C7酮类燃料调合组分，在乙醇/丙酮为6:1时酮产率53%，4-庚酮选择性达83%；3:1时4-庚酮选择性为55%，酮含量27 wt%。从葡萄糖出发的全流程集成获得920 mg/L 4-庚酮。该工作通过代谢工程与工艺条件协同调控解决了共生产比例不可控问题，为克服乙醇混合墙、生产高品质汽油和喷气燃料调合油提供了可行路线，且途径可转移至其他产乙醇微生物。
创新点
['采用酸非依赖的HMG-CoA途径生产丙酮，避免了CoA转移酶对乙酸/丁酸的高Km需求，同时允许乙醇共生产', '利用葡萄糖酸作为碳源平衡还原当量，实现对乙醇/丙酮比例的预测性调控', '组合不同来源的HMGS/HMGL和乙醇合成模块，首次实现了0.7:1到10:1宽范围的乙醇/丙酮摩尔比控制', '通过生物反应器微好氧条件和pH控制，将丙酮滴度提高到5.1 g/L，达到野生型Clostridium acetobutylicum水平', '集成化学催化，从生物质直接生产汽油/喷气燃料调合油组分，并创下4-庚酮最高产量记录']
研究对象（11）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3) | — | — | — | 能量供给 | 主要生产宿主，用于丙酮和乙醇共生产；相比其他菌株丙酮产量最高 |
| Escherichia coli BFA7(DE3) | — | — | — | 能量供给 | 敲除了zwf、mdh、frdA、ndh、pta、poxB、ldhA等竞争基因，具有更高的理论溶剂收率 |
| Escherichia coli MG1655(DE3) | — | — | — | 能量供给 | 测试菌株，丙酮产量低，主要产乙酸 |
| Clostridium acetobutylicum ATCC 824 | — | — | — | 能量供给 | 野生型菌株，作为丙酮产量的参考 |
| E. coli BL21(DE3) | 丙酮合成途径（HMG-CoA途径） | thl | 硫解酶 | 催化 | 来自Clostridium acetobutylicum，催化乙酰-CoA缩合生成乙酰乙酰-CoA |
| E. coli BL21(DE3) | 丙酮合成途径（HMG-CoA途径） | adc | 乙酰乙酸脱羧酶 | 催化 | 来自C. acetobutylicum，催化乙酰乙酸脱羧生成丙酮 |
| E. coli BL21(DE3) | 丙酮合成途径（HMG-CoA途径） | mvaS (HMGS) | HMG-CoA合酶 | 催化 | 来自Enterococcus faecalis或Lactobacillus acidophilus或Staphylococcus aureus，催化乙酰-CoA和乙酰乙酰-CoA缩合生成HMG-CoA |
| E. coli BL21(DE3) | 丙酮合成途径（HMG-CoA途径） | mvaB (HMGL) | HMG-CoA裂解酶 | 催化 | 来自Pseudomonas mevalonii或Acinetobacter baumannii或Bacillus subtilis，催化HMG-CoA裂解为乙酰乙酸和乙酰-CoA |
| E. coli BL21(DE3) | 乙醇合成途径 | adhE | 醛/醇脱氢酶 | 催化 | 来自E. coli MG1655，将乙酰-CoA经乙醛还原为乙醇 |
| E. coli BL21(DE3) | 乙醇合成途径 | pdc | 丙酮酸脱羧酶 | 催化 | 来自Zymomonas mobilis，催化丙酮酸脱羧生成乙醛 |
| E. coli BL21(DE3) | 乙醇合成途径 | adhB | 醇脱氢酶 | 催化 | 来自Z. mobilis，将乙醛还原为乙醇 |
关键发现
- 通过表达HMG-CoA合酶和裂解酶，在E. coli BL21中丙酮产量从0.14 g/L提高到5.1 g/L，超过35倍
- 乙醇/丙酮摩尔比可在0.7:1到10.0:1之间调控。使用葡萄糖酸作为碳源使BFA7 p7EFPM的乙醇/丙酮摩尔比从6.0降至3.4，丙酮产量增加近50%至0.94 g/L。共表达Z. mobilis pdc/adhB使乙醇产量达15.1 g/L（丙酮1.82 g/L），共表达E. coli adhE的p7LAAB/pK7AT在葡萄糖上丙酮产量达3.05 g/L。在750-mL生物反应器中，BL21 p7LAAB/pK7AT以葡萄糖为碳源产生3.90 g/L丙酮和4.50 g/L乙醇
- 以葡萄糖酸为碳源产生5.1 g/L丙酮和2.76 g/L乙醇（乙醇/丙酮摩尔比0.7:1）。催化升级实验中，乙醇/丙酮6:1时C5+酮产率53%，2-戊酮选择性17%，4-庚酮选择性83%，燃料调合中酮含量20 wt%
- 3:1时C5+酮产率43%，2-戊酮选择性45%，4-庚酮55%，酮含量27 wt%。从葡萄糖出发，p7EFAB/pK7AT发酵（乙醇/丙酮=5.5:1）结合催化产生920 mg/L 4-庚酮和1.06 g/L C5+酮。BFA7菌株溶剂收率为0.65，高于BL21的0.51。单基因删除验证了thl、HMGS、HMGL的必要性
- adc删除在BL21中仍能产生丙酮，但在BFA7中不能。
研究结论
通过代谢工程和环境条件控制，大肠杆菌能够以可调控的乙醇/丙酮摩尔比共生产两种产物，结合下游催化烷基化，可生产适合汽油和喷气燃料的高品质调合油组分。该策略为克服乙醇混合墙提供了新途径，且该途径可转移至其他工业产乙醇微生物如酵母。