Physiological, Biochemical, and Mathematical Studies of Micro-Aerobic Continuous Ethanol Fermentation by Saccharomyces cerevisiae. II: Intracellular Metabolite and Enzyme Assays at Steady State Chemostat Cultures
- 作者
- Ron Grosz, Gregory Stephanopoulos
- 单位
- Department of Chemical Engineering, Massachusetts Institute of Technology
- 杂志
- Biotechnology and Bioengineering（1990）
- DOI
- 10.1002/bit.260361007
- 所属领域
- 发酵工程
- 关键词
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解决的核心问题
解释微好氧连续乙醇发酵中比乙醇生产率随供氧率变化（先升后降）的代谢机制，以及ATP产量变化、消泡剂影响和生物量突变等现象的生化基础。
研究策略
在稳态恒化器培养中测定胞内代谢物（ATP、NADH、葡萄糖6-磷酸、丙酮酸、甘油、乙醇）浓度和关键酶（己糖激酶、醇脱氢酶）活性，通过交叉点分析识别限速步骤，结合文献机制提出假设。
研究路线图
核心内容
本研究通过稳态恒化器培养系统，系统考察了微好氧条件下酿酒酵母连续乙醇发酵中比乙醇生产率随供氧率呈先升后降的代谢机制。作者开发了一种快速过滤-萃取方法，有效消除胞外代谢物和培养基荧光干扰，从而在稳态条件下准确测定了胞内ATP、NADH、葡萄糖6-磷酸、丙酮酸、甘油和乙醇等代谢物浓度，以及己糖激酶和醇脱氢酶等关键酶活性。结果显示，当进料氧分压从0.38%降至0.024%时，比乙醇生产率增加超过50%，胞内ATP含量翻倍；进一步降至0.0058%时，生产率下降超过50%，而NADH浓度增加3倍。交叉点分析揭示限速步骤在不同氧水平下发生转移：低氧阶段葡萄糖转运受胞内ATP激活，而更低氧阶段下游激酶受高ATP抑制。此外，研究证明消泡剂通过降低甘油转运阻力影响代谢，且胞内乙醇浓度在误差范围内不高于胞外浓度。这些发现为解释ATP产量变化、消泡剂影响及生物量骤降现象提供了生化基础，并为后续数学模型建立提供了关键参数与机制假设。
创新点
开发了快速过滤-萃取方法消除胞外代谢物和培养基荧光干扰；发现葡萄糖转运受胞内ATP激活、下游激酶受高ATP抑制；证明消泡剂降低甘油转运阻力；证明胞内乙醇浓度不高于胞外浓度。
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae | 糖酵解/乙醇发酵 | — | hexokinase (己糖激酶) | 催化 | EC 2.7.1.1，催化葡萄糖磷酸化，参与糖酵解第一步 |
| Saccharomyces cerevisiae | 乙醇发酵 | — | alcohol dehydrogenase (醇脱氢酶) | 催化 | EC 1.1.1.1，催化乙醇与乙醛互变，NADH消耗步骤 |
| Saccharomyces cerevisiae | 糖酵解 | — | glucose transporter (葡萄糖转运蛋白) | 转运 | 推测受胞内ATP激活，在代谢加速阶段为限速步骤 |
| Saccharomyces cerevisiae | 糖酵解 | — | pyruvate kinase (丙酮酸激酶) 和 phosphoglycerate kinase (磷酸甘油酸激酶) | 催化 | 在最低氧条件下受高ATP/低ADP抑制，成为限速步骤 |
| Saccharomyces cerevisiae | 糖酵解 | — | phosphofructokinase (磷酸果糖激酶) | 催化 | 可能受高ATP别构抑制，参与代谢调控 |
| Saccharomyces cerevisiae | 能量代谢 | — | ATPase (ATP酶) | 催化 | 假设的ATP浪费反应，受氧和ATP浓度激活，影响ATP产量 |
关键发现
- 当进料氧从0.38%降至0.024%时，比乙醇生产率增加超过50%
- 进一步降至0.0058%时下降超过50%。在生产率上升区间，胞内ATP含量翻倍
- 在下降区间，NADH浓度增加3倍。高消泡剂培养物中胞内ATP水平持续较低，比乙醇生产率降低，生物量出现骤降。胞内乙醇与胞外浓度在误差范围内无显著差异。ATP产量随氧和ATP浓度变化，与ATP浪费反应有关。
研究结论
通过酶和胞内代谢物测定，识别了微好氧发酵中代谢率变化的关键限速步骤：低氧时葡萄糖转运（受ATP激活）和更低氧时下游激酶（受高ATP抑制）；解释了ATP产量变化、消泡剂效应和生物量骤降的机制，并将在第三部分建立数学模型。