Cultivation of an L-Lactate Dehydrogenase Mutant of Bacillus stearothermophilus in Continuous Culture with Cell Recycle
- 作者
- R. San Martin, D. Bushell, D. J. Leak, B. S. Hartley
- 单位
- Centre for Biotechnology, Imperial College of Science, Technology and Medicine, London, United Kingdom
- 杂志
- Biotechnology and Bioengineering（1994）
- DOI
- 10.1002/bit.260440105
- 所属领域
- 发酵工程
- 关键词
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解决的核心问题
提高嗜热菌Bacillus stearothermophilus LLD-15在连续培养中的乙醇体积产率，同时抑制回复突变株（产乳酸）的取代，维持菌株稳定性。
研究策略
采用细胞循环培养系统，比较完全细胞循环和部分细胞循环（恒定排放速率）对菌株稳定性和产率的影响，基于维护能模型预测细胞浓度，并控制比蔗糖消耗率低于回复突变阈值。
核心内容
该研究将细胞循环技术首次应用于嗜热脂肪芽孢杆菌LLD-15（L-乳酸脱氢酶突变株）的连续乙醇发酵，旨在提高乙醇体积产率并抑制回复突变株的取代。作者比较了完全细胞循环与部分细胞循环（恒定排放速率）两种运行方式，并基于维护能模型预测细胞浓度，同时将比蔗糖消耗率控制在回复突变阈值（4.0~4.2 g蔗糖/g细胞·h）以下。在1%（w/v）蔗糖、部分细胞循环（排放速率0.1 h⁻¹）条件下，总体稀释率从0.14升至0.62 h⁻¹，水相乙醇体积产率由0.35 g/L·h提高到1.40 g/L·h，按理论乙醇产率折算最高可达2.6 g乙醇/L·h。比蔗糖消耗率维持在约2.5 g蔗糖/g细胞·h，低于回复突变出现阈值，菌株稳定性得以保持。完全细胞循环时细胞在零生长后约10~15小时失活；维护能系数为1.6 g蔗糖/g细胞·h，细胞产率系数为0.105 g细胞/g蔗糖，模型预测与实验数据吻合。结果表明，部分细胞循环可显著提高高稀释率下的乙醇产率并维持菌株稳定，所建模型能有效描述系统行为，为后续进一步优化提供了基础。
创新点
首次将细胞循环技术应用于嗜热芽孢杆菌连续乙醇发酵，证明部分细胞循环可在高稀释率下维持菌株稳定并显著提高乙醇体积产率；建立基于维护能的数学模型，可准确预测完全和部分细胞循环过程中的细胞浓度变化。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Bacillus stearothermophilus LLD-15 | 乙醇发酵（丙酮酸代谢） | ldh（L-乳酸脱氢酶基因，突变缺失） | L-乳酸脱氢酶 (LDH) | 催化 | 突变株缺乏该酶活性，避免乳酸生成，使碳流转向乙醇。 |
| Bacillus stearothermophilus LLD-15 | PFL途径（丙酮酸→甲酸+乙酰辅酶A） | — | 丙酮酸甲酸裂解酶 (PFL) | 催化 | 厌氧条件下将丙酮酸转化为甲酸和乙酰辅酶A，是LLD-15主要的丙酮酸代谢途径之一。 |
| Bacillus stearothermophilus LLD-15 | PDH途径（丙酮酸→乙酰辅酶A+CO2） | — | 丙酮酸脱氢酶 (PDH) | 催化 | 在高蔗糖浓度和低pH时活性增强，产生额外的乙醇和CO2。 |
| Bacillus stearothermophilus LLD-R（回复突变株） | 乳酸发酵 | ldh（回复突变型） | L-乳酸脱氢酶 (LDH) | 催化 | 回复突变株在特定条件下取代LLD-15，导致乳酸积累和乙醇产率下降。 |
关键发现
- 在1%（w/v）蔗糖、部分细胞循环（D_b=0.1 h^-1）条件下，总体稀释率从0.14升至0.62 h^-1，水相乙醇体积产率从0.35 g/L·h提高到1.40 g/L·h，按理论乙醇产率计算最高达2.6 g乙醇/L·h
- 比蔗糖消耗率维持在约2.5 g蔗糖/g细胞·h，低于常规连续培养中回复突变出现的阈值（4.0~4.2 g蔗糖/g细胞·h）
- 完全细胞循环时细胞在零生长速率后约10~15小时失去活性
- 维护能系数m_s约为1.6 g蔗糖/g细胞·h，细胞产率系数Y_x/s为0.105 g细胞/g蔗糖，模型预测与实验值吻合。
研究结论
部分细胞循环结合恒定排放量使LLD-15菌株能在高稀释率下稳定运行，显著提高乙醇体积产率，维护能模型可准确描述和预测系统性能；但需解决泡沫导致的乙醇测量误差和乙醇抑制问题，未来可通过基因敲除构建更稳定的菌株或采用两级连续系统。