Improvement of Cloned \(\alpha\) -Amylase Gene Expression in Fed-Batch Culture of Recombinant Saccharomyces cerevisiae by Regulating both Glucose and Ethanol Concentrations Using a Fuzzy Controller
- 作者
- Sumihisa Shiba, Yoshio Nishida, Yong Soo Park, Shinji Iijima, Takeshi Kobayashi
- 单位
- Department of Biotechnology, Faculty of Engineering, Nagoya University
- 杂志
- Biotechnology and Bioengineering（1994）
- DOI
- 10.1002/bit.260440906
- 所属领域
- 发酵工程
- 关键词
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解决的核心问题
在重组酿酒酵母培养中，高浓度乙醇会抑制克隆基因的表达；需要同时将葡萄糖和乙醇浓度控制在低水平以提高α-淀粉酶产量。
研究策略
开发了基于模糊控制器的补料分批培养策略，在线监测葡萄糖和乙醇浓度，通过调整补糖速率同时将两者控制在设定值（葡萄糖0.15 g/L、乙醇2 g/L）。
核心内容
该研究针对重组酿酒酵母培养中乙醇积累抑制克隆基因表达的问题，开发了一种基于模糊控制器的补料分批培养策略。控制器在线监测葡萄糖和乙醇浓度，通过动态调整补糖速率将两者分别控制在0.15 g/L和2 g/L的设定值，其中最大补糖速率修正系数随细胞比生长速率和比葡萄糖消耗速率灵活变化。分批实验表明，乙醇浓度维持在2-5 g/L时基因表达水平较20 g/L时提高2倍。在补料分批培养中，携带SUC2启动子的pNA3重组菌株分泌α-淀粉酶活性达175 U/mL，而携带PGK启动子的pNA7菌株活性达392 U/mL，最大比活性为12.4 U/mg干细胞。与仅控制葡萄糖的策略相比，酶活性提高2-3倍，比活性提高3-4倍；面包酵母培养中葡萄糖和乙醇分别稳定在0.03±0.07 g/L和2.39±0.29 g/L，最大细胞浓度达31.8 g/L。结果表明，该双参数模糊控制策略能有效缓解乙醇抑制，显著提升重组蛋白表达水平，对工业酵母生产同样具有应用价值。
创新点
将模糊控制器的α值（最大补糖速率修正系数）设为随细胞比生长速率和比葡萄糖消耗速率动态变化的灵活值，从而更稳定地同时控制葡萄糖和乙醇浓度；首次将该双控制策略应用于重组酵母克隆基因表达。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae 20B-12/pNA3 | α-淀粉酶分泌表达通路 | α-amylase | α-淀粉酶 | 催化 | 由SUC2启动子驱动，KIL28信号序列引导分泌，受乙醇浓度影响 |
| Saccharomyces cerevisiae 20B-12/pNA7 | α-淀粉酶分泌表达通路 | α-amylase | α-淀粉酶 | 催化 | 由PGK启动子驱动，KIL28信号序列引导分泌，受乙醇浓度影响 |
| Saccharomyces cerevisiae 20B-12 | 基因表达调控 | SUC2 | — | 调控 | 启动子，受高浓度葡萄糖抑制、低浓度葡萄糖去抑制 |
| Saccharomyces cerevisiae 20B-12 | 基因表达调控 | PGK | — | 调控 | 启动子，受高浓度葡萄糖抑制、低浓度葡萄糖去抑制 |
| Saccharomyces cerevisiae 20B-12 | 蛋白质分泌 | KIL28信号序列 | KIL28信号肽 | 转运 | 引导α-淀粉酶分泌至胞外培养基 |
关键发现
- 在分批培养中，乙醇浓度控制在2-5 g/L时，基因表达水平比20 g/L时高2倍
- 使用模糊控制器的补料分批培养中，含pNA3（SUC2启动子）的重组酵母分泌α-淀粉酶活性达175 U/mL，最大比活性7.7 U/mg干细胞
- 含pNA7（PGK启动子）的活性达392 U/mL，最大比活性12.4 U/mg干细胞
- 与仅控制葡萄糖相比，酶活性提高2-3倍，比活性提高3-4倍。面包酵母培养中，葡萄糖和乙醇浓度分别稳定在0.03±0.07 g/L和2.39±0.29 g/L，最大细胞浓度为31.8 g/L。
研究结论
通过模糊控制器同时控制葡萄糖和乙醇浓度，能够显著改善重组酿酒酵母中α-淀粉酶的表达，该控制策略在工业酵母生产中亦有助于提高细胞得率。