Toward industrial production of isoprenoids in Escherichia coli: lessons learned from CRISPR-Cas9 based optimization of a chromosomally integrated mevalonate pathway
- 作者
- Jorge Alonso-Gutierrez, Daisuke Koma, Qijun Hu, Yuchen Yang, Leanne Jade G. Chan, Christopher J. Petzold, Paul D. Adams, Claudia E. Vickers, Lars K. Nielsen, Jay D. Keasling, Taek Soon Lee
- 单位
- Joint BioEnergy Institute (JBEI), 5885 Hollis Street, Emeryville, CA 94608, USA; Biological Systems & Engineering Division, Lawrence Berkeley National Laboratory, Berkeley, CA 94720, USA; Osaka Municipal Technical Research Institute, Osaka, Japan; Molecular Biophysics and Integrated Bioimaging Division, Lawrence Berkeley National Laboratory, Berkeley, CA 94720, USA; Australian Institute for Bioengineering and Nanotechnology, The University of Queensland, St. Lucia, QLD 4072, Australia; The Novo Nordisk Foundation Center for Biosustainability, Technical University of Denmark, 2970 Horsholm, Denmark; Department of Chemical & Biomolecular Engineering, University of California, Berkeley, Berkeley, CA 94720, USA; Department of Bioengineering, University of California, Berkeley, Berkeley, CA 94720, USA
- 杂志
- Biotechnology and Bioengineering（2018）
- DOI
- 10.1002/bit.26530
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
解决大肠杆菌作为工业宿主生产异戊二烯类化合物时存在的问题：无法利用蔗糖、缺乏对有毒甲羟戊酸（MVA）途径中间体的内源控制、以及异源途径在染色体上整合与优化困难。
研究策略
将蔗糖利用相关cscAKB操纵子整合到大肠杆菌DH1染色体上，并将异源MVA途径拆分三个操纵子整合到不同染色体位点，同时在应激响应启动子控制下表达；利用CRISPR-Cas9系统快速系统性地替换启动子（如替换为T7启动子）以优化染色体整合途径；结合蛋白质组学分析诊断表达瓶颈并指导工程优化。
研究路线图
核心内容
该研究以大肠杆菌DH1为底盘，探索染色体整合甲羟戊酸途径生产异戊二烯类化合物的工业可行性。作者首先将蔗糖利用cscAKB操纵子整合至染色体，获得能以蔗糖为碳源的菌株DS，结合质粒表达MVA途径时bisabolene产量约1 g/L，动态调控系统在蔗糖上产量约850 mg/L。随后将MVA途径拆分为T、M、B三个模块整合至不同染色体位点，但产量大幅下降至约77-138 μg/L。利用CRISPR-Cas9系统系统替换启动子，T模块替换为T7启动子的DK16产量约200-300 μg/L，T和B模块均替换的DK29产量约435 μg/L，较初始菌株提高约4倍；然而单独替换M或B模块反而使产量下降约2.5倍，同时替换三个模块则导致细胞死亡。蛋白质组学揭示染色体整合途径酶平均表达量仅为质粒系统的约十分之一，且不平衡表达产生毒性。研究表明，染色体途径优化受限于非存活中间表型，需发展多基因同步编辑与动态调控策略以推进工业应用。
创新点
1) 实现了大肠杆菌DH1利用蔗糖并整合染色体MVA途径生产双环倍半萜bisabolene；2) 建立了基于CRISPR-Cas9的染色体启动子快速替换方法，实现染色体整合途径的系统优化；3) 通过蛋白质组学分析揭示染色体整合途径蛋白表达水平远低于质粒系统，并发现了染色体工程中的毒性/失衡问题；4) 提出了面向工业应用的染色体代谢工程改进方向。
研究对象（13）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli DH1 | sucrose utilization | cscA | 蔗糖转化酶 | 催化 | 来自E. coli W，cscAKB操纵子的一部分，水解蔗糖 |
| Escherichia coli DH1 | sucrose utilization | cscK | 果糖激酶 | 催化 | 来自E. coli W，cscAKB操纵子的一部分，磷酸化果糖 |
| Escherichia coli DH1 | sucrose utilization | cscB | 蔗糖透性酶 | 转运 | 来自E. coli W，cscAKB操纵子的一部分，转运蔗糖 |
| Escherichia coli DH1 | MVA pathway (module T) | atoB | 乙酰辅酶A乙酰转移酶 | 催化 | 催化乙酰-CoA缩合为乙酰乙酰-CoA |
| Escherichia coli DH1 | MVA pathway (module T) | HMGS | HMG-CoA合酶 | 催化 | 来自金黄色葡萄球菌，催化乙酰乙酰-CoA与乙酰-CoA缩合为HMG-CoA |
| Escherichia coli DH1 | MVA pathway (module T) | HMGR | HMG-CoA还原酶 | 催化 | 来自金黄色葡萄球菌，催化HMG-CoA还原为甲羟戊酸 |
| Escherichia coli DH1 | MVA pathway (module M) | MK | 甲羟戊酸激酶 | 催化 | 来自酿酒酵母，催化甲羟戊酸磷酸化 |
| Escherichia coli DH1 | MVA pathway (module M) | PMK | 磷酸甲羟戊酸激酶 | 催化 | 来自酿酒酵母，催化磷酸甲羟戊酸进一步磷酸化 |
| Escherichia coli DH1 | MVA pathway (module M) | PMD | 甲羟戊酸二磷酸脱羧酶 | 催化 | 来自酿酒酵母，催化甲羟戊酸二磷酸脱羧生成IPP |
| Escherichia coli DH1 | MVA pathway (module B) | idi | 异戊烯基二磷酸异构酶 | 催化 | 来自大肠杆菌，催化IPP与DMAPP相互转化 |
| Escherichia coli DH1 | MVA pathway (module B) | ispA | 法尼基二磷酸合酶 | 催化 | 来自大肠杆菌，催化IPP与DMAPP缩合生成FPP |
| Escherichia coli DH1 | MVA pathway (module B) | AgBIS | 双环倍半萜合酶（bisabolene synthase） | 催化 | 来自冷杉，催化FPP环化为bisabolene |
| Escherichia coli DH1 | regulation of MVA pathway | T7RNAP | T7 RNA聚合酶 | 调控 | 由DE3溶原菌提供，驱动T7启动子控制的MVA途径基因转录 |
关键发现
- 将cscAKB整合后，DH1衍生菌株DS能以蔗糖为碳源生长并利用质粒表达MVA途径生产bisabolene，产量约1 g/L
- 动态调控系统（P_gadE + P_rstA）在蔗糖上产量约850 mg/L。将MVA途径拆分为T、M、B三个模块整合到染色体后，菌株DK1在葡萄糖和蔗糖上bisabolene产量分别约77 μg/L和138 μg/L，远低于质粒系统。经CRISPR-Cas9启动子替换优化：DK16（T模块用P_T7）产量约200 μg/L（葡萄糖）和300 μg/L（蔗糖），较DK4提高约2.5倍
- DK29（T和B模块均用P_T7）产量约435 μg/L（两种碳源），较DK4提高约4倍。然而单独将M模块（DK24）、B模块（DK2）或M+B模块（DK28）替换为P_T7时产量下降约2.5倍。蛋白质组学显示染色体整合途径酶平均表达水平仅为质粒系统的约1/10
- DK29中AtoB和HMGS的表达水平显著提高至与质粒系统相当，但HMGR反而下降。此外，同时替换三个模块的启动子未能成功，提示不平衡表达会导致细胞毒性/死亡。
研究结论
将质粒优化好的操纵子整合到基因组并使其最优工作并非易事，染色体上的不良工程选择可能导致细胞死亡而不仅是低产量。本研究结果表明，基于迭代替换和分析的染色体途径优化可能只能覆盖有限子空间，非存活中间体表型会阻碍最优表型的获得。因此，需要发展能同时进行多个染色体编辑的技术（如CRMAGE）以及动态调控系统，以实现工业相关菌株的构建。