Improving methyl ketone production in E. coli by heterologous expression of NADH-dependent FabG
- 作者
- Ee-Been Goh, Yan Chen, Christopher J. Petzold, Jay D. Keasling, Harry R. Beller
- 单位
- Joint BioEnergy Institute (JBEI), 5885 Hollis Street, Emeryville, CA 94608; Biological Systems & Engineering Division, Lawrence Berkeley National Laboratory, Berkeley, CA 94720; Departments of Chemical & Biomolecular Engineering and of Bioengineering, University of California, Berkeley, CA 94720; The Novo Nordisk Foundation Center for Biosustainability, Technical University of Denmark, Kogle Allee, DK2970- Hørsholm, Denmark; Earth and Environmental Sciences, Lawrence Berkeley National Laboratory, Berkeley, CA 94720
- 杂志
- Biotechnology and Bioengineering（2018）
- DOI
- 10.1002/bit.26558
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
脂肪酸衍生途径中NADPH消耗与NADH积累的不平衡导致甲基酮产量受限，需要缓解NADPH限制。
研究策略
通过异源表达NADH依赖的FabG变体（来自Acholeplasma laidlawii等），并利用Rex调控系统使其表达响应NADH/NAD+比例；优化质粒设计（单质粒整合）和发酵过程，结合shotgun proteomics分析生理变化。
研究路线图
核心内容
本研究针对大肠杆菌脂肪酸衍生甲基酮合成中NADPH消耗与NADH积累不平衡的问题，通过异源表达来自Acholeplasma laidlawii的NADH依赖型FabG（β-酮脂酰-ACP还原酶）来缓解NADPH限制。研究者利用Rex转录调控系统使fabG表达响应NADH/NAD+比例进行动态调控，并将rex-fabG元件与甲基酮合成途径基因整合至单质粒以解决双质粒不稳定问题。摇瓶实验中，表达A. laidlawii FabG的菌株在1%和2%葡萄糖下甲基酮产量比阴性对照分别高35%和75%；补料分批发酵中工程菌株获平均5.4±0.5 g/L甲基酮滴度，最高达6.0 g/L，比基础菌株提高约40%。shotgun蛋白质组学揭示了Pgi显著上调（达2.0倍）而MaeB下调（降至0.26倍），确证NADPH需求降低。该策略有效缓解了还原力不平衡，为其他脂肪酸衍生燃料和化学品的生产提供了可行方案。
创新点
1. 在好氧条件下异源表达NADH依赖型FabG（特别是A. laidlawii FabG）以改善甲基酮生产；2. 利用Rex-NADH/NAD+响应系统动态调控fabG表达；3. 将rex-fabG元件与甲基酮途径基因整合至单质粒，解决双质粒不稳定问题，实现最高6.0 g/L的甲基酮滴度；4. 通过蛋白质组学揭示NADPH限制缓解的机制。
研究对象（9）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| E. coli (DH1衍生株) | 脂肪酸生物合成途径 | Al_fabG | β-酮脂酰-ACP还原酶（来自Acholeplasma laidlawii） | 催化 | 异源表达NADH依赖型FabG，替代天然NADPH依赖型FabG，缓解NADPH消耗 |
| E. coli (DH1衍生株) | 脂肪酸生物合成途径 | rex | Rex转录抑制因子（来自Staphylococcus aureus） | 调控 | 响应NADH/NAD+比例，动态调控Al_fabG表达 |
| E. coli (DH1衍生株) | 甲基酮合成途径 | fadR | FadR转录调控因子 | 调控 | 调控脂肪酸降解/β-氧化相关基因表达 |
| E. coli (DH1衍生株) | 甲基酮合成途径 | fadD | FadD酰基-CoA合成酶 | 催化 | 催化游离脂肪酸生成脂酰-CoA |
| E. coli (DH1衍生株) | 甲基酮合成途径 | fadB | FadB β-氧化多功能酶 | 催化 | 参与β-氧化的烯脂酰-CoA水合酶和3-羟脂酰-CoA脱氢酶活性 |
| E. coli (DH1衍生株) | 甲基酮合成途径 | fadM | FadM硫酯酶 | 催化 | 催化脂酰-ACP水解生成游离脂肪酸 |
| E. coli (DH1衍生株) | 甲基酮合成途径 | ACO (Mlut_11700) | 酰基-CoA氧化酶 | 催化 | 异源表达，催化脂酰-CoA氧化为烯脂酰-CoA |
| E. coli (DH1衍生株) | 糖酵解途径 | pgi | 葡萄糖-6-磷酸异构酶 | 催化 | 蛋白质组学显示在EGS2920中上调，表明碳流更多进入糖酵解，NADPH需求降低 |
| E. coli (DH1衍生株) | 苹果酸代谢 | maeB | NADP+依赖的苹果酸酶 | 催化 | 蛋白质组学显示在EGS2920中下调，与NADPH需求降低一致 |
关键发现
- 在摇瓶中，表达A. laidlawii FabG的菌株EGS2715在1%和2%葡萄糖下，甲基酮产量比RFP阴性对照分别高35%和75%，比单质粒菌株EGS1895高19%和40%
- 在补料分批发酵中，工程菌株EGS2920获得平均5.4 ± 0.5 g/L的甲基酮滴度，最高达6.0 g/L，比基础菌株EGS1895提高约40%
- EGS1895经发酵优化后，从3.4 g/L提高到4.4 g/L，产率达到0.14 g MK/g葡萄糖（约42%最大理论产率）
- 蛋白质组学显示，与EGS1895相比，EGS2920中Pgi（葡萄糖-6-磷酸异构酶）显著上调（50/70/120h分别为2.0/1.5/1.8倍），MaeB（NADP+依赖苹果酸酶）下调（50/70h为0.26/0.51倍），表明NADPH需求降低。
研究结论
异源表达NADH依赖的FabG可有效缓解大肠杆菌脂肪酸衍生途径的NADPH限制，实现甲基酮产量和产率的显著提升。该方法有望应用于其他脂肪酸衍生燃料和化学品的生产。