High-level β-carotene production from xylose by engineered Saccharomyces cerevisiae without overexpression of a truncated HMG1 (tHMG1)
- 作者
- Liang Sun, Christine Anne Atkinson, Ye-Gi Lee, Yong-Su Jin
- 单位
- Department of Food Science and Human Nutrition, University of Illinois at Urbana-Champaign; Carl R. Woese Institute for Genomic Biology, University of Illinois at Urbana-Champaign
- 杂志
- Biotechnology and Bioengineering（2020）
- DOI
- 10.1002/bit.27508
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
酿酒酵母利用葡萄糖发酵生产β-胡萝卜素时受Crabtree效应影响，乙醇积累导致产量低，且通常需要过表达tHMG1来增强MVA途径通量；本研究旨在探索利用木糖作为碳源，是否能在不进行tHMG1过表达的情况下实现β-胡萝卜素的高效生产。
研究策略
将来自Xanthophyllomyces dendrorhous的β-胡萝卜素合成基因（crtYB、crtI、crtE）整合到木糖发酵菌株SR8中，构建SR8B；通过摇瓶发酵对比葡萄糖和木糖条件下的细胞生长、代谢物及β-胡萝卜素产量；通过qPCR分析相关基因表达；并通过补料分批发酵放大生产。
研究路线图
核心内容
本研究在木糖发酵酿酒酵母菌株SR8中整合了来自红发夫酵母的β-胡萝卜素合成基因crtYB、crtI和crtE，构建了工程菌SR8B，系统比较了葡萄糖与木糖作为碳源对β-胡萝卜素合成的影响。摇瓶发酵结果表明，以40 g/L木糖为碳源时β-胡萝卜素产量达96.4 mg/L，是葡萄糖条件下的约3倍（24.2 mg/L），比含量从3.9 mg/g DCW升至13.7 mg/g DCW。值得注意的是，过表达tHMG1在葡萄糖条件下能提升比含量至6.5 mg/g DCW，但在木糖条件下并无增益（12.0 vs 13.7 mg/g DCW），说明木糖本身已能提供充足的通量支撑。机制解析显示，木糖培养时ACS1和HMG1基因相对表达量分别上调2.7倍和2.2倍，乙酰辅酶A池增大，同时麦角固醇和脂质比含量分别较葡萄糖条件提高28%和58%，反映出木糖代谢赋予细胞更强的呼吸特征和异戊二烯前体供给。通过补料分批发酵放大，最终β-胡萝卜素产量达到772.8 mg/L，生产力5.4 mg/L/h，产物得率2.2 mg/g木糖。该策略无需额外的遗传扰动即可实现胡萝卜素的高效生产，为利用木糖作为碳源强化萜类化合物合成提供了可行路径。
创新点
首次在酿酒酵母中实现从木糖合成β-胡萝卜素；发现木糖替代葡萄糖可显著提高β-胡萝卜素产量且无需过表达tHMG1；揭示了木糖代谢带来的呼吸特征、乙酰辅酶A池增大及关键基因上调等机制。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae SR8 | 木糖同化途径 | XYL1, XYL2, XKS1 | 木糖还原酶、木糖醇脱氢酶、木酮糖激酶 | 催化 | 底盘菌株，整合表达木糖代谢基因，并删除ALD6 |
| Saccharomyces cerevisiae SR8B | β-胡萝卜素生物合成途径 | crtYB, crtI, crtE | 植物烯合酶/番茄红素环化酶(CrtYB)、植物烯脱氢酶(CrtI)、GGPP合酶(CrtE) | 催化 | 来自Xanthophyllomyces dendrorhous，整合于URA3位点 |
| Saccharomyces cerevisiae SR8BH | 甲羟戊酸(MVA)途径 | tHMG1 | 截短的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶 | 催化 | 在TDH3启动子控制下，通过CRISPR/Cas9整合到CS5位点 |
| Saccharomyces cerevisiae SR8B | 乙酰辅酶A代谢 | ACS1 | 乙酰辅酶A合成酶 | 催化 | 木糖条件下转录水平上调2.7倍 |
| Saccharomyces cerevisiae SR8B | 甲羟戊酸(MVA)途径 | HMG1 | 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶 | 催化 | 内源基因，木糖条件下转录水平上调2.2倍 |
关键发现
- 在40 g/L木糖摇瓶发酵中，SR8B菌株产β-胡萝卜素96.4 mg/L，是葡萄糖（42 g/L）产量24.2 mg/L的约3倍
- 比含量为13.7 mg/g DCW，远高于葡萄糖的3.9 mg/g DCW。过表达tHMG1（SR8BH）在葡萄糖条件下将比含量从3.9提高到6.5 mg/g DCW，但在木糖条件下没有改善（12.0 vs 13.7 mg/g DCW）。木糖培养时ACS1和HMG1相对表达量分别上调2.7±0.1倍和2.2±0.2倍。木糖条件下麦角固醇比含量为17.0±0.6 mg/g DCW，比葡萄糖高28%
- 脂质比含量为43.1 mg/g DCW，比葡萄糖（27.2 mg/g DCW）高58%。通过木糖补料分批发酵，最终获得772.8 mg/L β-胡萝卜素，生产力5.4 mg/L/h，产量2.2 mg/g木糖，细胞干重68.0 g/L。另外，木糖批发酵的β-胡萝卜素产量为2.4 mg/g木糖，而葡萄糖为0.4 mg/g葡萄糖。
研究结论
研究表明，利用木糖作为碳源能够在不进行tHMG1过表达及其他遗传扰动的情况下，显著提高酿酒酵母中β-胡萝卜素的产量，是一种有前景的生产策略。