高级醇 · 代谢工程文献库

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Fermentation and purification strategies for the production of betulinic acid and its lupane-type precursors in Saccharomyces cerevisiae

作者
Eik Czarnotta, Mariam Dianat, Marcel Korf, Fabian Granica, Juliane Merz, Jérôme Maury, Simo Abdessamad Baallal Jacobsen, Jochen Förster, Birgitta E. Ebert, Lars M. Blank
单位
iAMB - Institute of Applied Microbiology, ABBt - Aachen Biology and Biotechnology, RWTH Aachen University; APT - Laboratory of Plant and Process Design, Department of Biochemical and Chemical Engineering, TU Dortmund University; Technical University of Denmark, Novo Nordisk Foundation Center for Biosustainability; Carlsberg A/S
杂志
Biotechnology and Bioengineering（2017）
DOI
10.1002/bit.26377
所属领域
代谢工程
关键词
betulinic aciddownstream processingethanolpentacyclic triterpenoidsprocess developmentyeast
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解决的核心问题

利用酿酒酵母微生物发酵生产桦木酸及其羽扇豆烷型三萜前体，并开发高效的发酵和产物纯化策略，以替代从植物树皮中低效提取的现有工艺。

研究策略

将异源桦木酸生物合成途径导入酿酒酵母CEN.PK，结合乙醇补料（脉冲或恒浓度控制）和氮限制静息细胞发酵策略提高三萜产量，并通过溶剂萃取和酸沉淀开发下游纯化工艺。

研究路线图

100%
研究问题：微生物发酵替代植物提取桦木酸
策略：导入异源合成途径至酿酒酵母CEN.PK
关键改造：过表达tHMG1、ERG1、AtLUP1、CYP716A11、AtATR2
发酵策略1：乙醇脉冲补料提升产量
关键结果：总三萜854 mg/L，桦木酸182 mg/L
纯化策略：固液萃取+酸沉淀
结论：发酵+纯化策略可行，需提升菌株生产力
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核心内容

本研究在酿酒酵母CEN.PK中导入异源桦木酸及其羽扇豆烷型三萜前体的生物合成途径，通过过程工程策略实现高效发酵生产并开发下游纯化工艺。研究采用乙醇补料（包括脉冲补料和恒浓度控制）结合氮限制静息细胞发酵策略，显著提高了三萜产量。在氮限制静息细胞发酵中，桦木酸浓度达到182 mg/L，总三萜浓度达到854 mg/L，为当时报道的最高水平；恒乙醇浓度控制补料发酵中总三萜浓度达346 mg/L。与葡萄糖脉冲补料相比，乙醇脉冲补料使总三萜产量提高约1.5倍，碳收率提高2.4倍。在下游纯化方面，开发了无需细胞破碎的固液萃取结合酸沉淀方法，乙酸乙酯和丙酮萃取回收率分别达90±4%和91±2%，桦木酸回收率约86-104%，桦木素回收率最高达195±34%。该研究首次报道了重组酿酒酵母生产桦木酸的补料分批发酵策略，证明代谢工程与过程工程结合可高效生产三萜类化合物，为微生物替代植物提取工艺奠定了基础，但仍需进一步提高菌株特异性生产力和产物特异性。

创新点

首次报道重组酿酒酵母生产桦木酸的补料分批发酵策略；利用乙醇过量供给显著提高三萜产量；开发了无需细胞破碎的固液萃取和酸沉淀纯化方法。

研究对象（6）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
Saccharomyces cerevisiae CEN.PK 甲羟戊酸途径/三萜生物合成 AtLUP1 oxidosqualene cyclase (OSC) 催化 来自拟南芥，催化2,3-氧化鲨烯环化生成羽扇豆醇
Saccharomyces cerevisiae CEN.PK 桦木酸生物合成 CYP716A11 细胞色素P450单加氧酶 催化 来自长春花，催化羽扇豆醇三步氧化生成桦木酸
Saccharomyces cerevisiae CEN.PK 桦木酸生物合成 AtATR2 细胞色素P450还原酶 (CPR) 催化 来自拟南芥，提供电子传递
Saccharomyces cerevisiae CEN.PK 甲羟戊酸途径 tHMG1 截短的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶 催化 过表达以增强甲羟戊酸途径通量
Saccharomyces cerevisiae CEN.PK 甾醇/三萜生物合成 ERG1 鲨烯环氧酶 催化 过表达以增加2,3-氧化鲨烯供应
Saccharomyces cerevisiae CEN.PK 三萜生物合成 ATF1 醇乙酰转移酶 催化 推测作用于羽扇豆烷型三萜生成乙酸酯，影响产物谱

关键发现

  1. 在氮限制静息细胞发酵中，桦木酸浓度达到182 mg/L，总三萜浓度达到854 mg/L，为目前报道的最高值
  2. 恒乙醇浓度控制补料发酵中总三萜浓度达346 mg/L
  3. 乙醇脉冲补料相比葡萄糖脉冲补料总三萜产量提高约1.5倍，碳收率提高2.4倍
  4. 乙酸乙酯和丙酮萃取回收率分别达90±4%和91±2%，桦木酸回收率约86-104%，桦木素回收率最高达195±34%
  5. 摇瓶培养中桦木素和桦木酸比浓度分别达6.7 mg/gCDW和2.1 mg/gCDW。

研究结论

通过代谢工程与过程工程结合，酿酒酵母能够高效生产桦木酸及其前体，开发的发酵和纯化策略为微生物三萜生产提供了可行基础，但需进一步代谢工程提高菌株特异性生产力和产物特异性。