A synthetic biology approach to transform Yarrowia lipolytica into a competitive biotechnological producer of β-carotene
- 作者
- Macarena Larroude, Ewelina Celinska, Alexandre Back, Stephan Thomas, Jean-Marc Nicaud, Rodrigo Ledesma-Amaro
- 单位
- Micalis Institute, INRA, AgroParisTech, Université Paris-Saclay, 78350 Jouy-en-Josas, France; Poznan University of Life Sciences, Department of Biotechnology and Food Microbiology, ul. Wojska Polskiego 48, 60-627 Poznan, Poland; Department of Bioengineering, Imperial College London, London SW7 2AZ, UK
- 杂志
- Biotechnology and Bioengineering（2017）
- DOI
- 10.1002/bit.26473
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
如何通过合成生物学和代谢工程手段，将产油酵母解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）改造成具有竞争力的β-胡萝卜素工业生产菌株，克服天然不产类胡萝卜素、产量低等瓶颈。
研究策略
选用脂质过量生产菌株作为底盘，表达异源β-胡萝卜素合成途径（GGS1、CarB、CarRP）；过表达截短的HMG1；增加途径基因拷贝数；利用Golden Gate组装进行启动子改组（promoter shuffling），筛选最优启动子组合；结合补料分批发酵优化培养条件。
研究路线图
核心内容
本研究以脂质过量生产的解脂耶氏酵母为底盘，引入异源β-胡萝卜素合成途径基因GGS1、CarB和CarRP，并通过截短HMG1过表达、增加途径拷贝数以及Golden Gate组装介导的启动子改组逐步提升产量。结果显示，脂质过量菌株ob-C的β-胡萝卜素产量为8.9 mg/g DCW和35.7 mg/L，分别是野生型菌株wt-C的2.61倍和1.93倍；截短HMG1过表达后达17.4 mg/g DCW，额外增加一个途径拷贝后进一步提升至24.0 mg/g DCW。启动子改组筛选出TEF-TEF-TEF最优组合，菌株ob-CHCTEF摇瓶产量达54.4 mg/g DCW和293.3 mg/L，再增加拷贝获得的ob-CHCTEFCTEF摇瓶产量达61.1 mg/g DCW和454.36 mg/L。在5 L生物反应器补料分批发酵中，最高产量达6.5 g/L，含量89.6 mg/g DCW，同时积累40 g/L脂质且柠檬酸低于1 g/L。该结果表明，通过底盘选择与组合优化，解脂耶氏酵母可成为兼具β-胡萝卜素和脂质生产能力的工业菌株，为类胡萝卜素绿色制造提供了可行路径。
创新点
首次将Golden Gate组装与启动子改组用于解脂耶氏酵母β-胡萝卜素合成途径优化；发现脂质过量生产菌株背景显著提高β-胡萝卜素产量；构建的菌株ob-CHCTEFCTEF在摇瓶和补料分批发酵中创造了当时最高的β-胡萝卜素产量记录（6.5 g/L）。
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Yarrowia lipolytica | 类胡萝卜素生物合成路径 | GGS1 | 香叶基香叶基二磷酸合酶 | 催化 | 来自Yarrowia lipolytica，将FPP转化为GGPP |
| Yarrowia lipolytica | 类胡萝卜素生物合成路径 | CarB | 番茄红素环化酶/八氢番茄红素合成酶 | 催化 | 来自Mucor circinelloides |
| Yarrowia lipolytica | 类胡萝卜素生物合成路径 | CarRP | 八氢番茄红素脱氢酶 | 催化 | 来自Mucor circinelloides |
| Yarrowia lipolytica | 甲羟戊酸途径 | HMG1 | 3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶（截短版） | 催化 | 基因YALI0E04807，来自Yarrowia lipolytica，截短以增强通量 |
| Yarrowia lipolytica | 脂质代谢 | 未明确（脂质过量生产菌株JMY3501相关基因） | 未明确 | 调控 | 脂质过量生产菌株背景，通过更高乙酰辅酶A供应用于β-胡萝卜素合成，并增加脂质体储存 |
| Yarrowia lipolytica | β-胡萝卜素生物合成路径 | 无（启动子元件） | 无 | 调控 | 启动子TEFp（强）、PGMp（弱）、GAPDHp（中等），经Golden Gate组装进行启动子改组 |
关键发现
- 表达car-cassette后，野生型菌株wt-C产β-胡萝卜素3.4 mg/g DCW和18.4 mg/L
- 脂质过量菌株ob-C产8.9 mg/g DCW和35.7 mg/L，分别是wt-C的2.61倍和1.93倍
- 过表达截短HMG1后ob-CH产17.4 mg/g DCW和121.6 mg/L
- 增加一个car-cassette拷贝得到ob-CHC，产24.0 mg/g DCW和175.6 mg/L
- 启动子改组筛选出最优组合TEF-TEF-TEF，构建的ob-CHCTEF产54.4 mg/g DCW和293.3 mg/L
- 再增加一个carTEF-cassette拷贝得到ob-CHCTEFCTEF，摇瓶产量达61.1 mg/g DCW和454.36 mg/L，为当时摇瓶最高产量，产率为0.048 g/g葡萄糖
- 在5L生物反应器补料分批发酵中，使用Y20P40D培养基，最高产量达6.5 g/L β-胡萝卜素，含量89.6 mg/g DCW，产率0.036 g/g葡萄糖，同时伴随40 g/L脂质和低于1 g/L柠檬酸。
研究结论
通过选择脂质过量生产菌株作为底盘、优化启动子组合、增加基因拷贝数以及补料分批发酵，解脂耶氏酵母成功成为β-胡萝卜素的竞争力工业生产菌株，最高产量6.5 g/L，且同时高产脂质，具有工业化前景。