EXPRESSION OF TABERSONINE 16-HYDROXYLASE AND 16-HYDROXYTABERSONINE-O-METHYLTRANSFERASE IN CATHARANTHUS ROSEUS HAIRY ROOTS
- 作者
- Jiayi Sun, Le Zhao, Zengyi Shao, Jacqueline Shanks, Christie A. M. Peebles
- 单位
- Chemical and Biological Engineering Department, Colorado State University; Chemical and Biological Engineering, Iowa State University, Center for Biorenewable Chemicals
- 杂志
- Biotechnology and Bioengineering（2017）
- DOI
- 10.1002/bit.26487
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
长春花毛状根因缺少从tabersonine到vindoline的七步途径，无法积累vindoline，从而无法产生长春碱和长春新碱等抗癌药物前体。
研究策略
在长春花毛状根中利用糖皮质激素诱导型启动子表达vindoline途径前两个酶T16H和16OMT，将tabersonine导向vindoline生物合成；使用酵母生产中间产物标准品，结合LC/MS和HPLC分析代谢物变化，并用RT-qPCR检测TIA途径基因和调控因子的转录变化。
研究路线图
核心内容
该研究在长春花毛状根中利用糖皮质激素诱导型启动子过表达长春碱生物合成途径中vindoline支路的两个关键酶，即它波宁16-羟化酶（T16H）和16-羟基它波宁-O-甲基转移酶（16OMT），旨在将内源底物它波宁的代谢通量导向vindoline合成方向。通过构建多个转基因毛状根株系并结合LC/MS与HPLC分析，研究在诱导后观察到T16H和16OMT转录水平大幅上升，其中#S3株系T16H增加452倍、16OMT增加27倍。代谢物检测显示，原本不可检测的16-羟基它波宁和16-甲氧基它波宁在诱导后分别积累至每克干重0.15毫克和0.42毫克，同时它波宁含量下降26%，而蛇根碱等竞争途径产物显著减少，表明通量成功被导向目标支路。此外，研究还发现了两个推测为环氧化产物的意外新代谢物，并检测到TIA途径负调控因子ZCTs的转录上调。结果表明，仅表达vindoline途径前两步不足以合成终产物，但能有效重定向代谢流并引发复杂的转录响应，为后续构建完整vindoline途径或沉默竞争基因提供了基础。
创新点
['首次在毛状根中产生vindoline途径中间产物16-羟基它波宁和16-甲氧基它波宁', '发现了两个意外的新代谢物（推测为环氧化的16-羟基它波宁和16-甲氧基它波宁），揭示毛状根中TIA代谢谱的不可预期改变', '阐明了T16H和16OMT过表达引发TIA途径基因和调控因子的复杂转录响应']
研究对象（10）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Catharanthus roseus hairy roots | Vindoline pathway / Monoterpenoid indole alkaloid (TIA) pathway | T16H (tabersonine 16-hydroxylase) | Tabersonine 16-hydroxylase | 催化 | 催化tabersonine生成16-羟基它波宁，在诱导型启动子控制下过表达 |
| Catharanthus roseus hairy roots | Vindoline pathway / Monoterpenoid indole alkaloid (TIA) pathway | 16OMT (16-O-methyltransferase) | 16-hydroxytabersonine-O-methyltransferase | 催化 | 催化16-羟基它波宁生成16-甲氧基它波宁，在诱导型启动子控制下过表达 |
| Catharanthus roseus hairy roots | 19-O-acetylhohammericine pathway / Tabersonine metabolism | T19H (tabersonine 19-hydroxylase) | Tabersonine 19-hydroxylase | 催化 | 根原生tabersonine代谢酶，诱导后转录水平下调 |
| Catharanthus roseus hairy roots | 19-O-acetylhohammericine pathway / Tabersonine metabolism | MAT (minovincinine 19-hydroxy-O-acetyltransferase) | Minovincinine 19-hydroxy-O-acetyltransferase | 催化 | 根原生tabersonine代谢酶，诱导后转录水平下调 |
| Catharanthus roseus hairy roots | TIA upstream pathway | STR (strictosidine synthase) | Strictosidine synthase | 催化 | 催化严格osidine合成，表达在#S8中无变化，在#S3中未检测到显著变化 |
| Catharanthus roseus hairy roots | TIA upstream pathway | SGD (strictosidine beta-glucosidase) | Strictosidine beta-glucosidase | 催化 | 将strictosidine转化为aglycone，在#S3中上调 |
| Catharanthus roseus hairy roots | TIA regulation | ORCA2 | AP2-domain DNA-binding protein ORCA2 | 调控 | 正调控因子，在#S8中上调 |
| Catharanthus roseus hairy roots | TIA regulation | ORCA3 | AP2-domain DNA-binding protein ORCA3 | 调控 | 正调控因子，在#S8中下调 |
| Catharanthus roseus hairy roots | TIA regulation | ZCT1, ZCT2, ZCT3 | Zinc finger proteins | 调控 | 负调控因子，大多在诱导后显著上调（ZCT3在#S3中无变化） |
| Saccharomyces cerevisiae WAT11 | Vindoline pathway (heterologous) | T16H, 16OMT | Tabersonine 16-hydroxylase, 16-hydroxytabersonine-O-methyltransferase | 催化 | 用于生产16-羟基它波宁和16-甲氧基它波宁标准品 |
关键发现
- 诱导后#S3毛状根中T16H mRNA增加452±64倍、16OMT增加27±6倍
- #S8中T16H增加107±19倍、16OMT增加150±30倍。16-羟基它波宁从不可检测水平增加至#S3中0.15±0.88 mg/g DW和#S8中0.05±0.00 mg/g DW
- 16-甲氧基它波宁在#S3中增至0.15±0.06 mg/g DW、#S8中增至0.42±0.04 mg/g DW。tabersonine在#S8中减少26%
- catharanthine和ajmalicine在#S8中分别增加23%和21%，serpentine在#S3中增加43%。同时，根特异性生物碱lochnericine、19-羟基它波宁和hörhammericine显著下降，表明tabersonine被成功导向vindoline途径。
研究结论
在毛状根中单独表达vindoline途径前两步T16H和16OMT不足以合成vindoline，但成功将tabersonine通量导向vindoline中间产物，同时引发TIA途径的复杂转录响应，尤其是负调控因子ZCTs的上调。该研究为今后在毛状根中表达完整vindoline途径、敲除竞争途径（如T6,7E）及沉默负调控因子以实现vindoline高产提供了重要依据。