Cell free biosynthesis of isoprenoids from isopentenol
- 作者
- Valerie C.A. Ward, Alkiviadis Orfefs Chatzivasileiou, Gregory Stephanopoulos
- 单位
- Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, MA, USA; University of Waterloo, Waterloo, Ontario, Canada
- 杂志
- Biotechnology and Bioengineering（2019）
- DOI
- 10.1002/bit.27146
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
天然MEP和MVA途径需要复杂辅因子和多个酶，转录翻译调控严格，中间产物积累有毒，难以用于无细胞合成；需要一种简化、低成本、高灵活性的萜类化合物无细胞合成途径。
研究策略
利用异戊烯醇利用途径（IUP）在体外重构最小酶系统（单/倍半萜4个酶，二萜5个酶），通过酶动力学参数测定、代谢控制分析（MCA）、ODE建模和全局敏感性分析优化酶配比和过程参数，实现高产量紫杉二烯等萜类的无细胞合成。
研究路线图
核心内容
本研究基于异戊烯醇利用途径（IUP），在体外构建了仅含4–5个酶的最小化无细胞萜类合成系统，成功用于单萜、倍半萜和二萜的生产。通过酶动力学参数测定、代谢控制分析（MCA）、常微分方程建模及全局敏感性分析，系统优化了酶配比与反应条件。优化后该系统在9小时内合成220 mg/L紫杉二烯，总通量达24.4 mg/L·h，为当时报道最快系统的2.9倍，并将65%的异戊烯醇和ATP转化为产物。研究发现胆碱激酶是途径主要控制点，且途径不受中间产物反馈调控；ATP浓度超过10 mM即完全抑制产物合成，镁离子和约2 mM DTT为必需条件。全局敏感性分析显示IspA和GGPPS催化的缩合反应对紫杉二烯产量影响最大。该工作证明IUP无细胞平台以低成本原料和简洁酶系即可高效生产复杂二萜，为高价值萜类化合物的工业化合成提供了可行且易于进一步优化（如酶固定化、ATP再生）的新策略。
创新点
['首次在体外系统表征IUP途径并证明其可用于单萜、倍半萜和二萜的无细胞合成', '通过代谢控制分析发现胆碱激酶是途径主要控制点，且途径不受中间产物反馈调节，显著简化了代谢工程优化', '实现220 mg/L紫杉二烯产量，通量达24.4 mg/L·h，比此前报道最快系统快2.9倍']
研究对象（9）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| E. coli BL21(DE3) | Isopentenol Utilization Pathway (IUP) | ck | Choline kinase (CK) | 催化 | 来自酿酒酵母，催化异戊烯醇/异戊烯醇磷酸化，以ATP为磷酸供体；是途径的主要控制点 |
| E. coli BL21(DE3) | Isopentenol Utilization Pathway (IUP) | ipk | Isopentenyl phosphate kinase (IPK) | 催化 | 来自拟南芥，催化IP/DMAP磷酸化生成IPP/DMAPP |
| E. coli BL21(DE3) | Isopentenol Utilization Pathway (IUP) | idi | Isopentenyl pyrophosphate isomerase (IDI) | 催化 | 来自大肠杆菌，催化IPP与DMAPP互变；可省略但会降低产量 |
| E. coli BL21(DE3) | 萜类骨架途径 | ispA | Farnesyl pyrophosphate synthase (IspA) | 催化 | 来自大肠杆菌，催化IPP+DMAPP→GPP和IPP+GPP→FPP |
| E. coli BL21(DE3) | 萜类骨架途径 | ggps | Geranylgeranyl pyrophosphate synthase (GGPPS) | 催化 | 来自加拿大红豆杉，催化IPP+FPP→GGPP；浓度可降低5倍而不影响通量 |
| E. coli BL21(DE3) | 二萜合成 | tds | Taxadiene synthase (TDS) | 催化 | 来自短叶红豆杉，截短形式，催化GGPP环化生成紫杉二烯 |
| E. coli BL21(DE3) | 单萜合成 | ls | Limonene synthase (LS) | 催化 | 来自薄荷，催化GPP生成柠檬烯 |
| E. coli BL21(DE3) | 倍半萜合成 | vs | Valencene synthase (VS) | 催化 | 来自阿拉斯加花柏，催化FPP生成瓦伦烯 |
| E. coli BL21(DE3) | 倍半萜合成 | ads | Amorphadiene synthase (ADS) | 催化 | 来自黄花蒿，密码子优化，催化FPP生成紫穗槐二烯 |
关键发现
- 优化后的无细胞系统在9小时内产生220 mg/L紫杉二烯，总通量24.4 mg/L·h，将65%的异戊烯醇和ATP转化为产物，是此前报道最快紫杉二烯通量（8.5 mg/L·h）的2.9倍。ATP浓度超过10 mM时紫杉二烯合成完全被抑制
- ADP也有抑制作用，20 mM ATP+20 mM ADP导致蛋白沉淀。镁离子为必需，不添加时几乎无产物
- DTT最适浓度约2 mM。去除IDI并以异戊烯醇/异戊烯醇3:1底物替代，产量降低58%（24 mg/L vs 14 mg/L）。代谢控制分析发现5个显著弹性系数，高浓度IP轻微抑制CK，IP刺激IPK，IPP/DMAPP刺激IDI和IspA
- GGPPS浓度降低5倍不影响通量。全局敏感性分析识别出10个显著变量，其中IspA和GGPPS催化的两个缩合反应动力学参数对紫杉二烯产量影响最大。
研究结论
基于IUP的无细胞生物合成平台是生产高价值复杂环状二萜（如紫杉二烯）的有前景方法，仅需4-5个酶，原料低成本，产物易回收，且可通过酶固定化和ATP再生系统进一步降低成本和提高稳定性。