Transport-controlled growth decoupling for self-induced protein expression with a glycerol-repressible genetic circuit
- 作者
- Alvaro R. Lara, Flavio Kunert, Vincent Vandenbroucke, Hilal Taymaz-Nikerel, Luz María Martínez, Juan-Carlos Sigala, Frank Delvigne, Guillermo Gosset, Jochen Büchs
- 单位
- Department of Biological and Chemical Engineering, Aarhus University; Biochemical Engineering (AVT.BioVT), RWTH Aachen University; Terra Research and Teaching Centre, Microbial Processes and Interactions (MiPI), Gembloux Agro-Bio Tech, University of Liège; Department of Genetics and Bioengineering, Istanbul Bilgi University; Instituto de Biotecnologia, Universidad Nacional Autónoma de México; Departamento de Procesos y Tecnologia, Universidad Autónoma Metropolitana
- 杂志
- Biotechnology and Bioengineering（2024）
- DOI
- 10.1002/bit.28697
- 所属领域
- 代谢工程 / 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
在无需外部诱导剂和补料操作的简单分批培养中，实现细胞生长与重组蛋白表达的解耦，以提高蛋白产量并简化工艺。
研究策略
利用葡萄糖摄取突变株WGM（ΔptsG ΔmanX）降低葡萄糖摄取速率，以甘油-葡萄糖混合碳源实现快速生长后慢速生长的两阶段，并设计甘油抑制型遗传电路（GRC），在甘油耗尽后自动诱导重组蛋白表达。
研究路线图
核心内容
该研究提出一种基于碳源转运控制的生长解耦策略，用于在大肠杆菌简单分批培养中实现重组蛋白的自主诱导表达，无需外部诱导剂或补料操作。作者构建了葡萄糖摄取缺陷株WGM（ΔptsG ΔmanX），并结合甘油抑制型遗传电路（GRC），以葡萄糖和甘油为混合碳源进行培养。在生长阶段，WGM利用葡萄糖快速生长，比生长速率达0.41 h⁻¹，接近野生型，但葡萄糖摄取速率降至5.3 mmolC g⁻¹ h⁻¹；甘油耗尽后细胞自动进入慢速生产阶段，比生长速率降至0.10 h⁻¹，同时GRC解除抑制并启动蛋白表达。在含3.8 g/L甘油和18 g/L葡萄糖的培养中，最终荧光强度较强组成型启动子系统提高17%，且全过程无氧限制。流式细胞术显示GRC存在一定的泄漏表达和异质性，但整体系统在无干预条件下成功实现了生长与生产的时序分离。该策略以碳源转运控制替代传统诱导或补料手段，简化了工艺操作，同时低溢流代谢特性有利于高密度培养，为工业蛋白生产提供了一种更简便可行的自主诱导方案。
创新点
提出了基于碳源转运控制（而非传统诱导剂或补料）的生长解耦策略；设计了受甘油抑制的自主诱导基因电路（GRC）；无需外部干预即可在分批培养中模拟补料分批行为。
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 大肠杆菌W3110 | 磷酸转移酶系统（PTS） | ptsG | PtsG（IIBC^Glc） | 转运 | 葡萄糖特异性PTS组分，在WGM菌株中敲除以降低葡萄糖摄取速率 |
| 大肠杆菌W3110 | 磷酸转移酶系统（PTS） | manX | ManX（IIAB^Man） | 转运 | 甘露糖PTS组分，在WGM菌株中敲除以降低葡萄糖摄取速率 |
| 大肠杆菌W3110 | 甘油代谢 | glpF | GlpF | 转运 | 甘油通透酶，促进甘油跨膜扩散，受P_glpF启动子调控 |
| 大肠杆菌W3110 | 甘油代谢调控 | glpR | GlpR | 调控 | 甘油代谢抑制子，结合甘油-3-磷酸后失活，调控P_glpF |
| 大肠杆菌W3110 | 基因回路调控 | lacI | LacI | 调控 | 乳糖抑制子，抑制P_trc，在GRC中受P_glpF控制 |
| 大肠杆菌W3110 | 报告基因表达 | fbfp | FbFP | 催化 | 黄素单核苷酸荧光蛋白报告基因，用于监测蛋白表达 |
关键发现
- WGM在葡萄糖+甘油混合培养中μ=0.41±0.00 h^-1，接近野生型W3110（0.46±0.01），但葡萄糖摄取速率降至5.3±3.3 mmolC g^-1 h^-1
- 甘油耗尽后μ降至0.10±0.01 h^-1。在3.8 g/L甘油+18 g/L葡萄糖培养中，OTR峰值达43 mmol L^-1 h^-1，无氧限制
- 生长阶段SF约0.04 AU/AU，最终SF约0.70 AU/AU，比强组成型启动子（CPG）高17%。GRC在W3110中OFF态SF约为ON态的20%
- 流式细胞术显示，GRC在甘油抑制下仍有33%细胞表达FbFP，而ON态有13%不表达。WGM在单一葡萄糖培养中FbFP荧光比W3110低9%，但在混合碳源中终荧光比甘油高41%，比单一葡萄糖低16%。
研究结论
甘油抑制型遗传电路结合葡萄糖转运突变株E. coli WGM及葡萄糖-甘油混合碳源，在简单分批培养中有效实现了生长与重组蛋白表达的解耦，系统自主诱导、无需外部干预，且低溢流代谢特性有利于高密度培养，具备工业应用潜力。