RNAi Assisted Genome Evolution Unveils Yeast Mutants with Improved Xylose Utilization
- 作者
- Mohammad HamediRad, Jiazhang Lian, Hejun Li, Huimin Zhao
- 单位
- Department of Chemical and Biomolecular Engineering and Carl R. Woese Institute for Genomic Biology, University of Illinois at Urbana-Champaign; College of Chemical and Biological Engineering, Zhejiang University; Department of Agricultural and Biological Engineering, University of Illinois at Urbana-Champaign; Departments of Chemistry, Biochemistry, and Bioengineering, University of Illinois at Urbana-Champaign
- 杂志
- Biotechnology and Bioengineering（2017）
- DOI
- 10.1002/bit.26570
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
尽管SR8菌株已经过充分工程改造，但其木糖利用率和乙醇生产率仍存在瓶颈，难以进一步提高
研究策略
利用RNAi辅助基因组进化（RAGE）技术，构建基因组规模的全长cDNA过表达和下调文库，通过多轮筛选和基因组整合，叠加有益突变以提升木糖利用性能
研究路线图
核心内容
针对已经高度工程化的酿酒酵母SR8菌株木糖利用仍有瓶颈的问题，本研究采用RNAi辅助基因组进化（RAGE）技术，构建基因组规模的全长cDNA过表达与下调文库，通过多轮筛选并整合叠加有益突变。三轮RAGE后，最佳突变株的木糖消耗速率从1.16 g/L/h提升至1.50 g/L/h，乙醇生产率从0.33 g/L/h提升至0.48 g/L/h，分别提高29%和45%。研究鉴定出四个有益遗传靶点，包括已知的COX5A和MDH1过表达，以及新发现的VPS13过表达和必需基因CDC11的下调——后者通过RNAi实现，规避了敲除致死问题。qPCR验证了基因表达的有效调控，突变株在葡萄糖培养基中生长正常，在半乳糖培养基中生长更快。结果表明，在传统工程方法接近极限的菌株中，RAGE仍能通过组合过表达与下调突变挖掘新靶点、显著改善复杂表型，为代谢工程提供了一种可推广的迭代优化策略。
创新点
对已经高度工程化的SR8菌株进行迭代RAGE筛选；鉴定出两个已知（COX5A、MDH1）和两个新（VPS13、CDC11）效应基因；通过RNAi下调必需基因CDC11，避免了敲除致死问题
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae SR8 | 囊泡运输/膜形态发生 | VPS13 | Vps13 | 转运 | 过表达，参与液泡-线粒体界面互作和蛋白质分选 |
| Saccharomyces cerevisiae SR8 | 细胞周期/胞质分裂 | CDC11 | Cdc11 | 调控 | 下调，必需基因，编码septin组分 |
| Saccharomyces cerevisiae SR8 | 氧化磷酸化/呼吸链 | COX5A | Cox5a | 能量供给 | 过表达，细胞色素c氧化酶亚基Va |
| Saccharomyces cerevisiae SR8 | 三羧酸循环 | MDH1 | Mdh1 | 催化 | 过表达，线粒体苹果酸脱氢酶 |
关键发现
- 经过三轮RAGE，最佳突变株的木糖利用率提高29%，乙醇生产率提高45%（木糖消耗速率从1.16 g/L/h提升至1.50 g/L/h，乙醇生产率从0.33 g/L/h提升至0.48 g/L/h）
- 鉴定出VPS13过表达、CDC11下调、COX5A过表达、MDH1过表达四个有益靶点
- qPCR证实基因表达水平得到有效调控
- 在葡萄糖培养基中所有突变株生长相似，而在半乳糖培养基中突变株生长更快
研究结论
RAGE能够在传统工程方法已近极限的菌株中进一步挖掘新遗传靶点，通过组合过表达和下调突变显著提高木糖利用率和乙醇生产率，为复杂表型工程提供有效策略