A novel experimental method to determine substrate uptake kinetics of gaseous substrates applied to the carbon monoxide-fermenting Clostridium autoethanogenum
- 作者
- Maximilienne T. Allaart, Charilaos Korkontzelos, Diana Z. Sousa, Robbert Kleerebezem
- 单位
- Department of Biotechnology, Delft University of Technology, Delft, The Netherlands; Laboratory of Microbiology, Wageningen University & Research, Wageningen, Netherlands
- 杂志
- Biotechnology and Bioengineering（2024）
- DOI
- 10.1002/bit.28652
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
气体发酵中，CO底物摄取动力学参数缺乏可靠的实验验证，传统批量培养和稳态恒化器方法难以区分质量传递限制与生物转化能力，导致最大CO摄取速率（qCOmax）被严重低估。
研究策略
利用稳态恒化器培养Clostridium autoethanogenum，通过1小时CO分压脉冲扰动（最高至1.2 bar），结合在线尾气分析和气液质量平衡，测定生物量特异性CO摄取速率（qCO）和CO2产生速率（qCO2），并通过通量分布分析解析代谢转变。
研究路线图
核心内容
本研究开发了一种新的实验方法，通过在稳态恒化器培养Clostridium autoethanogenum时施加短时CO分压脉冲扰动（最高至1.2 bar），结合在线尾气分析和气液质量平衡，在恒定kLa条件下动态测定气体底物摄取动力学。结果显示，在pCO=1.2 bar时，生物量特异性CO摄取速率qCO达到-119±1 mmol g_x⁻¹ h⁻¹，较文献报道最高值（约-70 mmol g_x⁻¹ h⁻¹）高1.8倍，较动力学模型估计值（-37.5至-46.3 mmol g_x⁻¹ h⁻¹）高2.5-3.5倍，证明以往qCOmax被严重低估。qCO在0.1-1.2 bar范围内随pCO线性增加，未观察到CO抑制效应，表明该体系内CO转化始终受质量传递限制。通量分布分析进一步揭示，pCO≥0.6 atm时代谢从产乙酸转向产乙醇，最高Wood-Ljungdahl途径通量达13.6 mmol g_x⁻¹ h⁻¹，其中qCO₂在pCO=1.0 atm时达到约90 mmol g_x⁻¹ h⁻¹的平台。该工作不仅准确测定了C. autoethanogenum极高的CO转化能力，还表明通过调控CO传质速率即可控制乙酸/乙醇产物比例，为优化气体发酵提供了无需基因工程的新思路。
创新点
['开发了一种短时脉冲扰动稳态恒化器的新实验方法，可在恒定kLa条件下动态测定气体底物摄取动力学', '首次报道C. autoethanogenum在CO分压1.2 bar下达到-119±1 mmol g_x^-1 h^-1的极高qCO值，较以往数据高1.8-3.5倍', '基于在线尾气分析和通量分布分析，实时揭示了CO摄取速率驱动的乙酸向乙醇的代谢溢流转变']
研究对象（11）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Clostridium autoethanogenum DSM10061 | Wood-Ljungdahl途径（还原性乙酰-CoA途径） | CODH/ACS | 一氧化碳脱氢酶/乙酰-CoA合酶复合体 | 催化 | 催化CO氧化为CO2并合成乙酰-CoA |
| Clostridium autoethanogenum DSM10061 | 乙醇发酵（乙酸还原途径） | AOR | 乙醛氧化还原酶（aldehyde:ferredoxin oxidoreductase） | 催化 | 催化乙酸还原为乙醛 |
| Clostridium autoethanogenum DSM10061 | 乙醇发酵 | ALDH | 乙醛脱氢酶 | 催化 | 参与乙醛生成 |
| Clostridium autoethanogenum DSM10061 | 乙醇发酵 | ADH | 乙醇脱氢酶 | 催化 | 催化乙醛还原为乙醇 |
| Clostridium autoethanogenum DSM10061 | Wood-Ljungdahl途径 | FDH | 甲酸脱氢酶 | 催化 | 催化CO2还原为甲酸 |
| Clostridium autoethanogenum DSM10061 | Wood-Ljungdahl途径 | MTHFD | 亚甲基四氢叶酸脱氢酶 | 催化 | 参与四氢叶酸甲基分支 |
| Clostridium autoethanogenum DSM10061 | Wood-Ljungdahl途径 | MTHFR | 亚甲基四氢叶酸还原酶 | 催化 | 生成甲基四氢叶酸 |
| Clostridium autoethanogenum DSM10061 | 乙酸发酵 | ACK | 乙酸激酶 | 催化 | 催化乙酰磷酸转化为乙酸并生成ATP |
| Clostridium autoethanogenum DSM10061 | 能量代谢 | Rnf | Rnf复合体（Rhodobacter nitrogen fixation complex） | 能量供给 | 催化铁氧还蛋白与NAD+之间的电子转移，建立质子/钠离子梯度驱动ATP合成 |
| Clostridium autoethanogenum DSM10061 | 能量代谢 | Nfn | Nfn复合体（电子双歧复合体） | 能量供给 | 耦联NADH与铁氧还蛋白氧化还原，生成NADPH并贡献能量保存 |
| Clostridium autoethanogenum DSM10061 | 能量代谢 | ATPase | 膜结合ATP合酶 | 能量供给 | 利用Rnf建立的离子梯度合成ATP |
关键发现
['在pCO=1.2 bar时，qCO达到-119±1 mmol g_x^-1 h^-1，比文献报道最高值（约-70 mmol g_x^-1 h^-1）高1.8倍，比动力学模型估计值（-37.5至-46.3 mmol g_x^-1 h^-1）高2.5-3.5倍', 'qCO在0.1-1.2 bar范围内随pCO线性增加，未观察到CO抑制效应，表明CO转化在此体系内始终受质量传递限制', 'qCO2在pCO=1.0 atm时达到平台约90 mmol g_x^-1 h^-1，而qCO继续增加，差异源于产物谱变化', '代谢通量分析显示，pCO≥0.6 atm时乙酸净消耗，代谢从产乙酸转向产乙醇，最高Wood-Ljungdahl途径通量qWLP为13.6 mmol g_x^-1 h^-1', '稳态下Y_ATP为2.6 g_x/mol ATP，估算生长速率随pCO线性增加，但ATP/CO产率随乙醇通量增加而下降', '稳态培养（pCO=0.1 atm）时qCO约为-10 mmol g_x^-1 h^-1，qCO2约为6.2 mmol g_x^-1 h^-1']
研究结论
本研究建立的动态脉冲实验方法准确测定了C. autoethanogenum极高的CO摄取能力，证明以往报道的qCOmax被显著低估。代谢产物谱（乙酸/乙醇比例）可通过调控CO传质速率（即CO摄取速率）加以控制，为无需基因工程即可优化CO发酵产物提供了新思路，并强调了动力学参数专用实验验证的重要性。