Recombinant Shrimp (Litopenaeus vannamei) Trypsinogen Production in Pichia pastoris
- 作者
- Martha Guerrero-Olazarán, Luis L. Escamilla-Treviño, Mauricio Castillo-Galván, Juan A. Gallegos-López, José M. Viader-Salvadó
- 单位
- Facultad de Ciencias Biológicas, Instituto de Biotecnología, Universidad Autónoma de Nuevo León, San Nicolás de los Garza, Nuevo León, México
- 杂志
- Biotechnology Progress（2009）
- DOI
- 10.1002/btpr.197
- 所属领域
- 发酵工程
- 关键词
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解决的核心问题
首次在毕赤酵母中生产凡纳滨对虾胰蛋白酶原，克服重组胰蛋白酶原对宿主细胞的毒性以及蛋白不稳定导致产量低的问题。
研究策略
构建含虾胰蛋白酶原II cDNA与酿酒酵母α-交配因子信号肽融合的表达载体，整合到毕赤酵母GS115基因组，采用高细胞密度培养、每12小时补加甲醇，并比较BMM、BMMS、BMMA三种诱导培养基，其中添加丙氨酸的BMMA培养基效果最佳。
核心内容
本研究首次在毕赤酵母GS115中实现了凡纳滨对虾胰蛋白酶原的分泌表达。通过将虾胰蛋白酶原II cDNA与酿酒酵母α-交配因子信号肽融合，整合至AOX1启动子控制下，采用高细胞密度培养并每12小时补加甲醇诱导。比较三种诱导培养基，发现添加丙氨酸的BMMA效果最佳：诱导96小时后，SDS-PAGE和Western blot确认获得29 kDa重组虾胰蛋白酶原，浓度达14 μg/mL，占细胞外总蛋白的17%，此时OD600为82，pH维持在6.9；而BMM和BMMS培养基虽也支持生长，但pH降至2.5-2.8，总蛋白仅为23-38.5 μg/mL，BMM低密度培养未检出目标蛋白。所有条件下均未检测到胰蛋白酶活性，产物以酶原形式存在。生长动力学和超微结构分析表明重组胰蛋白酶原对宿主细胞具有毒性，表现为比生长速率下降及过氧化物酶体减少。丙氨酸通过维持中性pH和改善细胞活力，有效缓解了产物毒性并提高蛋白稳定性，为通过生物反应器放大实现更高产量奠定了基础。
创新点
首次在毕赤酵母中实现重组虾胰蛋白酶原的分泌表达；发现丙氨酸作为诱导培养基补充物通过维持pH和改善细胞活力，显著提高胰蛋白酶原产量。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Pichia pastoris GS115 | 甲醇利用途径 | AOX1启动子 | — | 调控 | 甲醇诱导型强启动子，控制外源基因转录 |
| Pichia pastoris GS115 | 蛋白分泌途径 | α-mating factor信号序列 | S. cerevisiae α-交配因子前导肽 | 转运 | 引导重组蛋白进入分泌通路 |
| Pichia pastoris GS115 | — | trypsinogen II cDNA | 虾胰蛋白酶原II | 催化 | 以无活性的酶原形式分泌，避免对宿主细胞毒性 |
关键发现
- 在BMMA培养基、高细胞密度、每12h补加甲醇诱导96h后，SDS-PAGE和Western blot确认获得29 kDa的重组虾胰蛋白酶原，浓度达14 μg/mL，占细胞外总蛋白的17%；最终OD600为82，pH为6.9，细胞外总蛋白浓度93.0 μg/mL。相比之下，BMM低密度培养未检测到目标蛋白，BMM高密度培养的总蛋白为23.1 μg/mL（OD600 68，pH
- 8），BMMS为38.5 μg/mL（OD600 89，pH
- 5）。所有培养条件下均未检测到胰蛋白酶活性，表明产物以酶原形式存在。RT-PCR证实所有诱导条件下均存在782 bp的胰蛋白酶原转录本。生长动力学显示重组胰蛋白酶原对宿主细胞具有毒性：在BMM中GS115-Tg2的比生长速率为0.091/h，而对照菌株为0.137/h（OD600测定）；CFU测定显示BMM中细胞数量下降（比生长速率-0.02/h），而BMMS和BMMA分别为0.191/h和0.062/h。超微结构分析显示甲醇诱导的GS115-Tg2细胞出现细胞损伤和过氧化物酶体减少，提示胞内活化引起毒性。
研究结论
通过高细胞密度培养和丙氨酸补充的诱导培养基，毕赤酵母能够成功生产并分泌重组虾胰蛋白酶原，产量达14 μg/mL；丙氨酸通过维持中性pH和提升细胞活力及蛋白稳定性，克服了胰蛋白酶原的毒性问题。该方法有望通过生物反应器放大实现更高产量。