Enhanced Arsenate Uptake in Saccharomyces cerevisiae Overexpressing the Pho84 Phosphate Transporter
- 作者
- Michael W.Y. Shen, Dhawal Shah, Wilfred Chen, Nancy Da Silva
- 单位
- Dept. of Chemical Engineering and Materials Science, University of California, Irvine; Dept. of Chemical and Biomolecular Engineering, University of Delaware
- 杂志
- Biotechnology Progress（2012）
- DOI
- 10.1002/btpr.1531
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
砷酸盐污染水体中砷酸盐的去除效率低，缺乏高效、经济的生物修复方法，特别是利用酿酒酵母作为生物吸附剂增强砷酸盐内化的研究尚未开展。
研究策略
在酿酒酵母中利用2μ质粒和晚期ADH2启动子过表达磷酸盐转运蛋白Pho84p，构建静息细胞体系，评估其在高浓度和痕量浓度砷酸盐条件下的摄取能力，并考察细胞密度、磷酸盐竞争、ACR3和FPS1基因缺失等因素的影响。
研究路线图
核心内容
该研究在酿酒酵母中利用2μ质粒和晚期ADH2启动子过表达磷酸盐转运蛋白Pho84p，构建静息细胞体系用于砷酸盐生物修复。工程菌株在12,000和30,000 ppb砷酸盐缓冲液中特异性摄取量最高达750 μg As/g细胞，比对照提高50%；在120 ppb痕量浓度下10分钟内完全去除砷酸盐，使残留低于10 ppb。PHO84 mRNA水平较对照提高约28–29倍。研究发现50 μM磷酸盐存在时摄取量仅降低约15%，表明转运体对砷酸盐具有较高选择性；提高细胞密度2.5倍可使体积摄取量成比例增加而比摄取量不变。ACR3和FPS1基因缺失未能阻止高浓度下细胞内砷的泄漏，提示后期泄漏受其他途径调控。该工作首次证明过表达Pho84p的静息酵母细胞能快速高效去除水溶液中的砷酸盐，转运不再限制总去除能力，但进一步提高需上调下游还原和隔离途径（如Acr2p和植物螯合肽）以增强容纳能力并减少泄漏。
创新点
首次在静息酿酒酵母体系中过表达Pho84p用于砷酸盐生物修复；采用晚期ADH2启动子实现高表达；系统研究了高浓度和痕量浓度下的摄取动力学、细胞密度效应、磷酸盐竞争及砷外排途径。
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae BY4742 | 砷代谢/砷酸盐摄取 | PHO84 | Pho84p | 转运 | 高亲和力磷酸盐转运蛋白，共转运砷酸盐 |
| Saccharomyces cerevisiae BY15616 | 砷代谢/砷外排 | ACR3 | Acr3p | 转运 | 砷外排蛋白，敲除后用于减少砷外排 |
| Saccharomyces cerevisiae BY15616 | 砷代谢/砷外排 | FPS1 | Fps1p | 转运 | 双向砷通道蛋白，敲除后未阻止砷泄漏 |
| Saccharomyces cerevisiae | 砷代谢/砷还原 | ACR2 | Acr2p | 催化 | 砷酸盐还原酶，将As(V)还原为As(III) |
| Saccharomyces cerevisiae | 砷代谢/砷隔离 | YCF1 | Ycf1p | 转运 | 将砷转运至液泡进行隔离 |
| Escherichia coli XL1 Blue | — | — | — | 催化 | 用于质粒构建和扩增 |
关键发现
- 在12,000和30,000 ppb砷酸盐缓冲液中，工程菌株特异性摄取量最高达750 μg As/g细胞，比对照提高50%
- 在120 ppb痕量浓度下10分钟内完全去除砷酸盐，使残留低于10 ppb
- PHO84 mRNA水平比对照高约28-29倍
- 50 μM磷酸盐存在下，6,000 ppb砷酸盐的摄取量仅降低约15%，70 ppb时只降低初始速率而不影响总量
- 提高细胞密度2.5倍使体积摄取量成比例增加而比摄取量不变
- ACR3和FPS1敲除未能阻止高浓度下细胞内砷的泄漏
- 质粒稳定性工程菌为54-63%，对照大于90%。
研究结论
过表达Pho84p的静息酿酒酵母细胞能快速高效地去除水溶液中的砷酸盐，且转运不再限制总去除能力；进一步提高需要上调下游还原和隔离途径（如Acr2p和植物螯合肽）以增加容纳能力并减少泄漏。