Developing an Industrial Artemisinic Acid Fermentation Process to Support the Cost-Effective Production of Antimalarial Artemisinin-Based Combination Therapies
- 作者
- Jacob R. Lenihan, Hiroko Tsuruta, Don Diola, Neil S. Renninger, Rika Regentin
- 单位
- Amyris Biotechnologies, 5980 Horton Street, Suite 450, Emeryville, CA 94608
- 杂志
- Biotechnology Progress（2008）
- DOI
- 10.1002/btpr.27
- 所属领域
- 发酵工程
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
青蒿素联合疗法是目前最有效的抗疟药物，但植物来源的青蒿素供应不稳定且价格昂贵，导致许多需要的人无法负担。需要开发一种经济可行的替代来源，如通过微生物发酵生产青蒿素前体青蒿酸，以稳定供应并降低成本。
研究策略
利用代谢工程改造的酿酒酵母Y51菌株，以化学限定培养基进行补料分批发酵；以半乳糖作为碳源和诱导剂；通过甲硫氨酸调控ERG9基因表达以减少甾醇合成竞争；设计DO-stat算法同时控制搅拌和补料，实现高密度发酵和高产青蒿酸。
核心内容
该研究针对青蒿素供应不稳定、价格昂贵的问题，开发了利用代谢工程酿酒酵母Y51菌株工业化生产青蒿素前体青蒿酸的补料分批发酵工艺。研究者使用化学限定培养基，以半乳糖作为碳源和诱导剂，并通过甲硫氨酸调控ERG9基因表达以减少甾醇合成对前体的竞争。关键创新在于设计了DO-stat算法同时控制搅拌和补料，实现高密度发酵。结果显示，基础补料分批发酵中青蒿酸产量为1.3 g/L，添加甲硫氨酸后产量提升至1.8 g/L，采用DO-stat算法后产量进一步达到2.5 g/L，细胞密度OD600达120，体积产率为0.43 g/L/天，整体较此前报道的100 mg/L提高了25倍。该工艺为青蒿素半合成提供了经济可行的原料来源，有助于稳定青蒿素供应并降低联合疗法的价格。
创新点
1. 开发了化学限定培养基的补料分批发酵工艺，将青蒿酸产量从摇瓶的100 mg/L提高到2.5 g/L，提高25倍。2. 利用Pmet3启动子调控ERG9基因，添加甲硫氨酸使产量从1.3 g/L提高到1.8 g/L。3. 改进的DO-stat算法同时控制搅拌和补料，将产量从1.8 g/L提高到2.5 g/L。
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae Y51 | 甲羟戊酸途径 | tHMGR | 截短的HMG-CoA还原酶 | 催化 | 由GAL1启动子驱动，增强前体异戊二烯供应 |
| Saccharomyces cerevisiae Y51 | 甲羟戊酸途径 | ERG20 | 法尼基焦磷酸合酶 | 催化 | 由GAL1启动子驱动，催化IPP/DMAPP生成FPP |
| Saccharomyces cerevisiae Y51 | 甾醇合成途径 | ERG9 | 鲨烯合酶 | 催化 | 由Pmet3启动子控制，甲硫氨酸抑制其表达以减少竞争通量 |
| Saccharomyces cerevisiae Y51 | 甲羟戊酸途径/甾醇合成途径 | UPC2-1 | UPC2转录因子 | 调控 | 由GAL1启动子驱动，可能上调甾醇合成相关基因以增强通量 |
| Saccharomyces cerevisiae Y51 | 青蒿酸生物合成途径 | — | amorphadiene synthase | 催化 | 由GAL1启动子驱动，催化FPP生成amorphadiene |
| Saccharomyces cerevisiae Y51 | 青蒿酸生物合成途径 | — | amorphadiene oxidase | 催化 | 由GAL10启动子驱动，催化amorphadiene氧化为青蒿酸 |
| Saccharomyces cerevisiae Y51 | 青蒿酸生物合成途径 | — | cytochrome P450 reductase | 催化 | 由GAL1启动子驱动，为P450氧化酶提供电子 |
关键发现
- 在摇瓶中，使用生物反应器批培养基时青蒿酸产量为197±40 mg/L，OD600为9.3
- 使用SD培养基为76±20 mg/L，OD600为2.4。在补料分批发酵中，以半乳糖为碳源和诱导剂时，最高细胞密度OD600为110，青蒿酸产量为1.3 g/L。添加甲硫氨酸后，产量提高至1.8 g/L（为对照的1.4倍）。采用DO-stat算法后，最高细胞密度OD600为120，青蒿酸产量达2.5 g/L
- 在葡萄糖补料后切换半乳糖的工艺中，细胞密度达OD600 200，产量为2.3 g/L。三次重复DO-stat工艺实验平均产量为2.5±0.1 g/L，体积产率为0.43 g/L/day。整体比之前报道的100 mg/L提高25倍。
研究结论
成功开发了酿酒酵母高密度补料分批发酵生产青蒿酸的工业级工艺，通过DO-stat同时控制搅拌和补料，实现了2.5 g/L的青蒿酸产量，相比此前报道的100 mg/L提高了25倍。该工艺为青蒿素半合成提供了经济可行的原料来源，有助于稳定青蒿素供应并降低ACTs的价格。