Cloning, Expression and Characterization of Xylose Isomerase from the Marine Bacterium Fulvimarina pelagi in Escherichia coli
- 作者
- Curtis A. Lajoie, Joshua B. Kitner, Stephen J. Potochnik, Jakob M. Townsend, Christopher C. Beatty, Christine J. Kelly
- 单位
- School of Chemical, Biological, and Environmental Engineering, Oregon State University; Trillium FiberFuels, Inc.
- 杂志
- Biotechnology Progress（2016）
- DOI
- 10.1002/btpr.2309
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
缺乏在酵母发酵低pH和低温条件下具有高活性且对钙和木糖醇抑制剂耐受的木糖异构酶，用于纤维素乙醇的同步异构化/发酵。
研究策略
从海洋细菌Fulvimarina pelagi基因组中鉴定木糖异构酶基因xylA，克隆并在Escherichia coli中表达，通过纯化和酶学表征研究其性质。
研究路线图
核心内容
研究人员从海洋细菌Fulvimarina pelagi基因组中鉴定出木糖异构酶基因xylA，克隆并在大肠杆菌Rosetta-gami 2 (DE3)中成功表达，通过镍柱纯化获得重组酶（rXI）并对其酶学性质进行了系统表征。结果显示该酶为约160 kDa的四聚体，最适pH约为7，在pH 5.5时仍保有活性，KM仅为1.75–4.17 mM（pH 6.5, 35°C），Vmax为0.142 U/mg纯化酶，对钙离子和木糖醇的抑制常数分别约2500 mg/L和大于50 mM，表现出显著的低底物亲和常数和高抑制剂耐受性。在补料分批发酵中，最高rXI活性达24 U/L（0.016 U/mg蛋白），且25°C下诱导12小时较5小时蛋白产量提高约5倍。该酶的低KM和强耐受特性使其在含钙及木糖醇的复杂生物质水解液中具有应用潜力，适合用于纤维素乙醇的同步异构化/发酵工艺，但在低pH（<6）和低温（30°C）条件下其催化效率仍需进一步提升以满足酵母发酵的实际需求。
创新点
发现来自海洋细菌的木糖异构酶具有极低的KM（1.75-4.17 mM）和对钙（KI约2500 mg/L）及木糖醇（KI>50 mM）的高耐受性，这些特性适合在复杂生物质水解液和酵母发酵条件下应用。
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli Rosetta-gami 2 (DE3) | 木糖异构化途径 | xylA | 木糖异构酶 (XI) | 催化 | 重组表达来自Fulvimarina pelagi的木糖异构酶基因 |
| Fulvimarina pelagi HTCC2506T | 木糖异构化途径 | xylA | 木糖异构酶 (XI) | 催化 | 目的基因来源菌株 |
关键发现
- 重组木糖异构酶（rXI）最适pH约为7，在pH
- 5仍有活性；分子量约160 kDa；Vmax为0.142 U/mg纯化酶，KM为1.75-4.17 mM（pH
- 5, 35°C）；钙的KI估计为2500 mg/L，木糖醇的KI>50 mM；在补料分批发酵中最高rXI活性达24 U/L（0.016 U/mg蛋白）。在摇瓶培养中，25°C诱导12h比5h产量高约5倍。
研究结论
来自F. pelagi的木糖异构酶基因可在E. coli中成功表达，重组酶具有低KM和高钙/木糖醇耐受性，有望应用于生物燃料生产中的木糖异构化；但在低pH（<6）和低温（30°C）下需要更高的Vmax。