Expression of Biologically Active Human Clotting Factor IX in Drosophila S2 Cells: γ-Carboxylation of a Human Vitamin K-Dependent Protein by the Insect Enzyme
- 作者
- Jafar Vatandoost, Alireza Zomorodipour, Majid Sadeghizadeh, Roghayeh Aliyari, Mettine H. A. Bos, Fariba Ataei
- 单位
- Dept. of Genetics, Tarbiat Modares University, Tehran, Iran; Dept. of Molecular Genetics, National Institute of Genetic Engineering and Biotechnology, Tehran, Iran; Dept. of Plant Pathology and Microbiology, Institute for Integrative Genome Biology, University of California, Riverside, CA 92521; Dept. of Thrombosis and Hemostasis, Leiden University Medical Center, Einthoven Laboratory for Experimental Vascular Medicine, Leiden, The Netherlands
- 杂志
- Biotechnology Progress（2012）
- DOI
- 10.1002/btpr.723
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
在果蝇S2细胞中高效表达具有生物活性的人凝血因子IX，并验证其内源γ-谷氨酰羧化酶能否完成人维生素K依赖蛋白的γ-羧基化修饰。
研究策略
构建金属硫蛋白启动子调控的hFIX表达质粒，转染果蝇S2细胞，并与CHO细胞比较表达效率；通过钡柠檬酸盐沉淀和凝血活性检测验证γ-羧基化；进一步共表达人γ-羧化酶以提升hFIX的产量和γ-羧基化水平。
研究路线图
核心内容
该研究构建了金属硫蛋白启动子调控的人凝血因子IX（hFIX）表达质粒，并转染果蝇S2细胞，以评估该昆虫细胞系能否高效生产具有生物活性的人维生素K依赖蛋白。结果显示，S2细胞分泌hFIX最高达670 ng/mL（第3天），凝血活性最高为157 mU/mL；瞬时表达水平比CHO细胞高12倍，活性高7倍，稳定表达水平高3倍、活性高5倍，分泌效率达68%–94%。钡柠檬酸盐沉淀实验证实，18%–22%的分泌FIX为完全γ-羧基化，首次在体内证明果蝇内源γ-谷氨酰羧化酶（dγC）能识别人类VKD蛋白前肽并完成该修饰。进一步共表达人γ-羧化酶（hγC）后，hFIX抗原量和凝血活性均提高约2倍，完全γ-羧基化比例增至32%，钡沉淀量最高增加1.43倍。该结果说明果蝇S2细胞具备正确γ-羧基化人凝血因子的能力，共表达人γ-羧化酶可进一步提升产量与修饰效率，为生产有活性维生素K依赖蛋白提供了新表达系统。
创新点
首次在体内证明果蝇dγC能识别人类VKD蛋白前肽并完成γ-羧基化；S2细胞表达hFIX的水平显著高于CHO细胞；共表达人γ-羧化酶可提高hFIX的表达和γ-羧基化效率。
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Drosophila S2细胞 | — | — | — | 区室化 | 表达宿主，提供内质网进行γ-羧基化修饰 |
| CHO细胞 | — | — | — | 区室化 | 对照表达系统 |
| Drosophila S2细胞 | γ-羧化/凝血级联 | hFIX | 人凝血因子IX | 催化 | 目标重组蛋白，凝血级联中的丝氨酸蛋白酶原 |
| Drosophila S2细胞 | γ-羧化 | dγC | 果蝇γ-谷氨酰羧化酶 | 催化 | 内源酶，催化hFIX的γ-羧基化 |
| Drosophila S2细胞 | γ-羧化 | hγC | 人γ-谷氨酰羧化酶 | 催化 | 共表达以提高γ-羧基化效率 |
| Drosophila S2细胞 | — | Mtn启动子 | — | 调控 | 金属硫蛋白启动子，受铜离子诱导调控hFIX表达 |
关键发现
- S2细胞分泌hFIX最高达670 ng/mL（第3天），凝血活性最高157 mU/mL
- 瞬时表达比CHO细胞高12倍，活性高7倍
- 稳定表达比CHO细胞高3倍，活性高5倍
- 分泌效率为68%–94%
- 钡柠檬酸盐沉淀显示18%–22%的分泌FIX为完全γ-羧基化
- 共表达hγC使FIX抗原量和凝血活性均提高约2倍，完全γ-羧基化比例增至32%，最高沉淀增加1.43倍
- 共表达后分泌效率为63%–91%。
研究结论
果蝇S2细胞具备高效表达和正确γ-羧基化人凝血因子IX的能力，可作为生产有活性维生素K依赖蛋白的新表达系统；共表达人γ-羧化酶能进一步改善hFIX的产量和γ-羧基化程度。