Enhanced accumulation of betulinic acid in transgenic hairy roots of Senna obtusifolia growing in the sprinkle bioreactor and evaluation of their biological properties in various biological models
- 作者
- Tomasz Kowalczyk, Przemysław Sitarek, Monika Toma, Patricia Rijo, Eva Domínguez-Martíne, Irene Falcó, Gloria Sánchez, Tomasz Śliwiński
- 单位
- Department of Molecular Biotechnology and Genetics, University of Lodz, Banacha 12/16, 90-237, Lodz, Poland; Department of Biology and Pharmaceutical Botany, Medical University of Lodz, Muszynskiego 1, 90-151, Lodz, Poland; Laboratory of Medical Genetics, Faculty of Biology and Environmental Protection, University of Lodz, Pomorska 141/143, 90-236 Lodz, Poland; CBIOS - Research Center for Biosciences & Health technologies, Universidade Lusofona de Humanidades e Tecnologias, Campo Grande 376, 1749-024 Lisboa, Portugal; iMed.ULisboa - Research Institute for Medicines, Faculdade de Farmácia da Universidade de Lisboa, Av. Prof. Gama Pinto, 1649-003 Lisboa, Portugal; Department of Biomedical Sciences, Faculty of Pharmacy, University of Alcalá, Campus universitario. Ctra. Madrid-Barcelona km. 33,600 28805 Alcalá de Henares, Spain; Department of Biotechnology, Institute of Agrochemical and Food Technology (IATA-CSIC), Av. Agustín Escardino, 7, Paterna, 46980 Valencia, Spain; Department of Medical Biochemistry, Medical University of Lodz, 6/8 Mazowiecka Str, 92-215, Lodz, Poland
- 杂志
- Chemistry & biodiversity（2021）
- DOI
- 10.1002/cbdv.202100455
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
提高Senna obtusifolia转基因毛状根中桦木酸（betulinic acid）的积累，并通过喷洒式生物反应器实现规模化培养，同时评估提取物的抗癌、抗菌和抗病毒生物活性。
研究策略
利用发根农杆菌（Rhizobium rhizogenes）介导的遗传转化，在Senna obtusifolia毛状根中过表达人参鲨烯合酶基因PgSS1（SOPSS2系），并以不含该基因的转化毛状根（SOA41系）为对照，在10 L喷洒式生物反应器中培养35天，通过HPLC分析次生代谢物含量，并采用MTT、克隆形成、Western blot、微量稀释法和病毒滴度测定评估生物活性。
研究路线图
核心内容
本研究利用发根农杆菌介导的遗传转化，在Senna obtusifolia毛状根中过表达人参鲨烯合酶基因PgSS1（SOPSS2系），并以未转基因的SOA41系为对照，在10 L喷洒式生物反应器中培养35天以实现规模化生产。结果显示，两系毛状根鲜重均增殖约25倍，但SOPSS2系的桦木酸含量达38.12 mg/g DW，较对照的4.21 mg/g DW提高约9倍，同时PgSS1基因的高表达得到证实。生物活性评估表明，SOPSS2提取物对U-87MG胶质母细胞瘤细胞的IC50约为0.36 mg/mL（对照约0.7 mg/mL），处理后仅约5%的细胞保持增殖能力，并显著上调Bax、p53等凋亡相关蛋白；抗菌测试中，SOPSS2对金黄色葡萄球菌的MIC为62.5 μg/mL，对粪肠球菌为156 μg/mL；抗病毒实验中，5 mg/mL提取物使猫杯状病毒滴度降低4.17 log10，均优于对照。该研究首次证明代谢工程结合生物反应器培养可高效提升高价值三萜类化合物的积累，为植物次生代谢物的工业化生产提供了可行策略。
创新点
首次将过表达PgSS1的Senna obtusifolia转基因毛状根在10 L喷洒式生物反应器中规模化培养；桦木酸含量较对照提高约9倍（38.125 vs 4.213 mg/g DW）；系统评估了其抗肿瘤（U-87MG胶质母细胞瘤）、抗菌和抗病毒（猫杯状病毒）活性。
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Senna obtusifolia 毛状根（SOPSS2和SOA41系） | 甲羟戊酸途径/三萜生物合成 | PgSS1 | 鲨烯合酶（squalene synthase） | 催化 | 在SOPSS2系中过表达，催化两分子FPP生成角鲨烯，促进桦木酸积累 |
| Senna obtusifolia 毛状根 | 毛状根诱导相关 | rolB, rolC | — | 调控 | 来自Rhizobium rhizogenes A4，用于毛状根转化，PCR验证其存在 |
关键发现
- 在10 L喷洒式生物反应器中培养35天后，SOPSS2和SOA41毛状根鲜重分别为247±6 g和250±2 g，均约25倍增殖，干重分别为25±0.7 g和25±0.6 g；HPLC分析显示，SOPSS2系桦木酸含量为38.12±0.27 mg/g DW，显著高于SOA41系的4.21±0.36 mg/g DW，且蒽醌含量存在差异（如aloe-emodin: SOA41
- 54±0.05 mg/g DW, SOPSS2
- 76±0.16 mg/g DW）；PgSS1基因在SOPSS2中高表达；MTT试验显示SOPSS2提取物对U-87MG细胞的IC50约为0.36 mg/mL，SOA41约为0.7 mg/mL；克隆形成试验中IC50浓度处理后，SOPSS2仅约5%细胞保持增殖能力，SOA41约20%；凋亡相关蛋白Bax、p53、Noxa、Puma均上调，SOPSS2作用更强；抗菌试验显示MIC范围为62.5–625 μg/mL，MBC为500–5000 μg/mL，SOPSS2对粪肠球菌MIC为156 μg/mL，对金黄色葡萄球菌MIC为62.5 μg/mL；抗病毒试验中，5 mg/mL的SOPSS2提取物使猫杯状病毒滴度降低4.17 log10，SOA41降低3.69 log10。
研究结论
本研究首次证明，过表达人参鲨烯合酶基因PgSS1的Senna obtusifolia转基因毛状根在10 L喷洒式生物反应器中培养后，能显著提高桦木酸含量（38.12 mg/g DW），并表现出更强的细胞毒性、抗增殖、凋亡诱导、抗菌和抗病毒活性，为利用代谢工程和生物反应器规模化生产高价值次生代谢物提供了有效策略。