Improved Expression of His6-Tagged Strictosidine Synthase cDNA for Chemo-Enzymatic Alkaloid Diversification
- 作者
- Liuqing Yang, Hongbin Zou, Huaijian Zhu, Martin Ruppert, Jingxu Gong, Joachim Stöckigt
- 单位
- Institute of Materia Medica, College of Pharmaceutical Sciences, Zhejiang University, 388 Yu Hang Tang Road, Hangzhou 310058, P. R. China; Department of Pharmaceutical Biology, Institute of Pharmacy and Biochemistry, Johannes-Gutenberg University, Staudinger-Weg 5, D-55128 Mainz; State Key Laboratory of Drug Research, Shanghai Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Sciences, 555 Zu Chong Zhi Road, Shanghai 201203, P. R. China
- 杂志
- Chemistry & Biodiversity（2010）
- DOI
- 10.1002/cbdv.201000052
- 所属领域
- 合成生物学
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解决的核心问题
严格定斯啶合酶（STR1）在大肠杆菌中异源表达时溶解度低、易形成包涵体，导致可溶性活性酶产量不足，限制了其用于生物碱多样化合成的规模。
研究策略
构建不同的表达载体（pQE-2和pET28a），共表达分子伴侣pG-Tf2或pG-LJE8，比较九种表达系统，优化表达条件；利用His6标签实现酶的一步纯化和固定化，用于酶催化合成新型strictosidine类似物。
研究路线图
核心内容
针对严格定斯啶合酶（STR1）在大肠杆菌中可溶性表达不足的问题，本研究系统比较了九种表达系统，通过载体选择、双His标签构建及分子伴侣共表达进行优化。结果显示，共表达伴侣蛋白pG-Tf2可使His6-STR1产量由0.341 mg/L提升至0.658 mg/L，酶活性由33.83 nKat/L提高至67.15 nKat/L，均约翻倍；而pG-LJE8共表达效果不佳。最优系统采用pET28a双His标签联合pG-Tf2，获得0.727 mg/L的可溶性STR1。利用Ni-NTA一步固定化His6-STR1，成功催化7-azatryptamine与secologanin合成新型12-azastrictosidine，产率达50.2%，并进一步衍生化获得产率57.7%的lactam tetraacetate。该策略显著提升了STR1的可溶性表达与催化效率，为化学酶法多样化合成生物碱类天然产物提供了实用平台。
创新点
1) 发现共表达分子伴侣pG-Tf2可使His6-STR1的产量和活性约提高一倍；2) 构建了N端和C端双His标签的pET28a表达系统，进一步提高了STR1产量；3) 利用固定化His6-STR1成功酶催化合成新型的12-azastrictosidine，产率达50.2%。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3) | strictosidine biosynthesis (monoterpenoid indole alkaloid biosynthesis) | STR1 cDNA (GenBank Y00756.1) from Rauvolfia serpentina | His6-tagged strictosidine synthase (STR1) | 催化 | 催化tryptamine与secologanin立体选择性缩合生成3α(S)-strictosidine |
| Escherichia coli M15 | strictosidine biosynthesis | STR1 cDNA | His6-STR1 (pQE-2系统) | 催化 | 系统A/B/C的宿主 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | — | — | 分子伴侣 pG-Tf2 (TF + GroEL/GroES) | 调控 | 共表达提高STR1可溶性 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | — | — | 分子伴侣 pG-LJE8 | 调控 | 共表达效果低于pG-Tf2 |
| Escherichia coli | strictosidine biosynthesis | — | His6-tagged STR1 immobilized on Ni-NTA | 催化 | 固定化酶催化合成12-azastrictosidine |
关键发现
['通过共表达分子伴侣pG-Tf2，His6-STR1的产量从系统A的0.341 mg/L提高到系统B的0.658 mg/L，活性从33.83 nKat/L提高到67.15 nKat/L，均约翻倍。', '最优表达系统H（pET28a双His标签+BL21(DE3)+pG-Tf2）获得0.727 mg/L STR1，活性44.29 nKat/L。', '固定化His6-STR1酶催化7-azatryptamine与secologanin合成12-azastrictosidine，产量0.7 g，产率50.2%。', '12-azastrictosidine lactam tetraacetate产率57.7%（73 mg）。', '表达系统A中His6-STR1约占总蛋白30%，其中70%为包涵体。', '伴侣蛋白pG-LJE8共表达效果差，产量低于无伴侣对照或相当。']
研究结论
通过伴侣蛋白共表达和双His标签策略，显著提高了STR1在大肠杆菌中的可溶性表达量，固定化His6-STR1能高效催化生成strictosidine及其类似物，为化学酶法多样化合成生物碱提供了实用平台。