Enzymatic Formation of Multiple Triterpenes by Mutation of Tyrosine 510 of the Oxidosqualene-Lanosterol Cyclase from Saccharomyces cerevisiae
- 作者
- Tung-Kung Wu, Cheng-Hsiang Chang
- 杂志
- ChemBioChem（2004）
- DOI
- 10.1002/cbic.200400079
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
探究酿酒酵母氧化角鲨烯-羊毛甾醇环化酶（ERG7）第510位酪氨酸（Tyr510）残基对环化产物特异性和催化机理的影响，以理解三萜环化酶如何控制环化/重排反应。
研究策略
对ERG7的509-513位氨基酸进行丙氨酸扫描突变，并额外构建Tyr510Trp和Tyr510Lys突变体，通过质粒穿梭实验、体内功能互补、非皂化脂提取及GC-MS、NMR等产物分析，结合同源建模研究该残基的催化作用。
核心内容
该研究通过丙氨酸扫描及定点突变，系统考察了酿酒酵母氧化角鲨烯-羊毛甾醇环化酶（ERG7）第510位酪氨酸（Tyr510）对环化产物特异性的调控作用。研究者构建了Tyr510Ala、Tyr510Lys和Tyr510Trp等突变体，利用体内功能互补、非皂化脂提取以及GC-MS和NMR等手段分析产物积累情况。结果显示，Y510A突变体可同时产生achilleol A、lanosterol和parkeol三种三萜产物，比例为27:39:34，且能恢复ERG7缺陷型酵母的生长；而Y510K和Y510W突变体则分别积累achilleol A与camelliol C（比例86:14和96:4），总产量约0.2 mg/L培养基，仅为野生型的2%，且无法互补生长缺陷。同源建模提示Tyr510羟基与羊毛甾醇C10阳离子距离约4.0 Å，Y510W突变后吲哚环与底物类似物距离缩短至约2.3 Å，可能阻碍环化超过单环阶段。该结果表明Tyr510既促进四环骨架形成，又稳定C8/C9阳离子以完成去质子化，单点突变即可显著改变三萜产物谱，为扩展三萜骨架多样性提供了工程化改造思路。
创新点
首次报道酿酒酵母ERG7单点突变（Tyr510Ala）可同时产生achilleol A、lanosterol和parkeol三种产物；首次报道ERG7突变体产生camelliol C；揭示了Tyr510在促进四环骨架形成和稳定羊毛甾醇C8/C9正离子去质子化中的双重作用。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae | 三萜生物合成（氧化角鲨烯环化） | ERG7 | 氧化角鲨烯-羊毛甾醇环化酶（Erg7p） | 催化 | 野生型及Y510A突变体：产生achilleol A、lanosterol和parkeol（比例27:39:34） |
| Saccharomyces cerevisiae | 三萜生物合成（氧化角鲨烯环化） | ERG7 | 氧化角鲨烯-羊毛甾醇环化酶（Erg7p） | 催化 | Y510K突变体：产生achilleol A和camelliol C（比例86:14），产量约为野生型的2% |
| Saccharomyces cerevisiae | 三萜生物合成（氧化角鲨烯环化） | ERG7 | 氧化角鲨烯-羊毛甾醇环化酶（Erg7p） | 催化 | Y510W突变体：产生achilleol A和camelliol C（比例96:4），产量约为野生型的2% |
关键发现
- ERG7 Y510A突变体积累achilleol A、lanosterol和parkeol的比例为27:39:34
- Y510K和Y510W突变体分别积累achilleol A与camelliol C的比例为86:14和96:4，且总产量约0.2 mg/L培养基，约为野生型ERG7的2%
- Y510K和Y510W无法互补ERG7缺陷型酵母的生长，而Y510A可以恢复生长
- 同源模型显示Tyr510羟基与羊毛甾醇C10阳离子距离约4.0 Å，突变Y510W后吲哚环与2-氮杂角鲨烯C6距离缩短至约2.3 Å，可能阻碍环化超过单环阶段。
研究结论
ERG7的Tyr510残基对于控制氧化角鲨烯环化/重排的进程和产物特异性至关重要，突变该残基可产生多种不完全环化和异常去质子化产物，表明该残基既参与促进四环形成，也参与稳定羊毛甾醇C8/C9阳离子以完成去质子化；这体现了微小突变可改变产物谱，为通过分子进化和代谢工程扩展三萜骨架多样性提供了潜力。