Identification of the First Bacterial Monoterpene Cyclase, a 1,8-Cineole Synthase, that Catalyzes the Direct Conversion of Geranyl Diphosphate
- 作者
- Chiaki Nakano, Hyo-Kyoung Kim, Yasuo Ohnishi
- 杂志
- ChemBioChem（2011）
- DOI
- 10.1002/cbic.201100330
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
细菌中缺乏能直接催化香叶基二磷酸(GPP)转化为单萜的环化酶，此前仅报道过倍半萜环化酶和以2-甲基GPP为底物的2-甲基异冰片合酶，尚未发现直接利用GPP的细菌单萜环化酶。
研究策略
基于基因组挖掘，以链霉菌UC5319的pentalenene合成酶为查询序列，在S. clavuligerus ATCC 27064中筛选到单结构域倍半萜环化酶同源基因cnsA，通过异源表达、体内产物鉴定及体外酶学分析确定其功能。
核心内容
本研究首次从细菌中鉴定出直接催化香叶基二磷酸（GPP）生成单萜的环化酶CnsA。通过以链霉菌UC5319的pentalenene合成酶为查询序列进行基因组挖掘，在S. clavuligerus ATCC 27064中筛选到单结构域倍半萜环化酶同源基因cnsA，并在S. lividans中异源表达。GC-MS分析显示重组菌产生单一主要产物，质谱m/z为154，经标准品比对确认为1,8-桉叶素。纯化的重组CnsA与GPP体外反应生成1,8-桉叶素，而与FPP反应无产物，证实其专一性为单萜环化酶。动力学参数为KM=170±3.3 nM，kcat=0.079±0.002 s⁻¹，催化效率（kcat/KM=0.46 s⁻¹ μM⁻¹）显著高于多种植物来源的1,8-桉叶素合酶。该发现打破了细菌倍半萜环化酶同源物仅催化倍半萜的假设，表明细菌中单萜生物合成可能广泛存在，为微生物萜类化合物多样性的认识提供了新视角。
创新点
首次鉴定出细菌来源的直接催化GPP生成1,8-桉叶素的单萜环化酶CnsA，打破了细菌SC同源物仅催化倍半萜的假设，表明细菌中单萜生物合成可能广泛存在。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Streptomyces clavuligerus ATCC 27064 | 单萜生物合成 | cnsA (SSCG_00536) | CnsA (1,8-cineole synthase) | 催化 | 首次鉴定的细菌单萜环化酶，催化香叶基二磷酸(GPP)环化生成1,8-桉叶素 |
| Streptomyces lividans TK21 | 单萜生物合成 | cnsA | CnsA | 催化 | 异源表达cnsA验证体内产生1,8-桉叶素 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 体外蛋白表达 | cnsA | CnsA (His-tagged) | 催化 | 用于重组蛋白生产和纯化，进行体外酶活及动力学分析 |
关键发现
- CnsA与已知细菌倍半萜环化酶（pentalenene synthase）有34%氨基酸序列一致性
- 在S. lividans中异源表达cnsA后，GC-MS检测到单一主要产物，其质谱m/z为154（对应C10H18O），经与标准品比对确认为1,8-桉叶素
- 纯化的重组CnsA与GPP体外反应生成1,8-桉叶素，与FPP反应无产物，证明其是单萜环化酶
- 动力学参数为KM=170±3.3 nM，kcat=0.079±0.002 s⁻¹，kcat/KM=0.46 s⁻¹ μM⁻¹，显著高于植物1,8-桉叶素合酶（拟南芥0.005、烟草0.003、希腊鼠尾草0.0008 s⁻¹ μM⁻¹）
- 野生型S. clavuligerus在标准培养条件下未检测到1,8-桉叶素产生。
研究结论
CnsA是首次鉴定的能高效催化GPP直接转化为1,8-桉叶素的细菌单萜环化酶，与细菌倍半萜环化酶同源，表明细菌SC同源物中包含单萜环化酶，细菌萜类化合物的多样性可能远比以往认识广泛。