A Novel Labda-7,13E-dien-15-ol-Producing Bifunctional Diterpene Synthase from Selaginella moellendorffii
- 作者
- Sibongile Mafu, Matthew L. Hillwig, Reuben J. Peters
- 杂志
- ChemBioChem（2011）
- DOI
- 10.1002/cbic.201100336
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
揭示卷柏中一个新型双功能二萜合酶SmCPSKSL1的催化功能，该酶能通过前所未有的II类环化反应生成内环双键，并通过I类反应水解生成labda-7,13E-dien-15-ol。
研究策略
克隆天然基因并在大肠杆菌中异源表达，结合代谢工程提高前体供给，通过GC-MS和NMR鉴定产物，并通过体外纯化酶实验验证催化功能。
核心内容
该研究克隆了卷柏中一个新型双功能二萜合酶基因SmCPSKSL1，并在大肠杆菌C41中异源表达，通过共表达GGPP合酶提高前体供给以探究其催化功能。利用GC-MS和NMR鉴定产物结构，并通过体外纯化酶实验验证催化机制。结果显示，重组菌株主要产生labda-7,13E-dien-15-ol，约占总产物的80%，从2升培养物中纯化获得18毫克产物。体外实验证实该酶在磷酸酶抑制剂存在下仍能直接生成目标产物。关键创新在于：该酶通过II类环化反应在C7亚甲基去质子化形成内环双键，不同于常规的C8外环甲基去质子化；同时其I类反应直接以水取代二磷酸基团生成羟基，这是首次报道的I类二萜合酶水解机制。该发现表明单个双功能酶即可完成从GGPP到labda-7,13E-dien-15-ol的合成，为理解此类天然产物在植物中趋同进化的机制提供了新视角，也为二萜类化合物的异源生物合成提供了新的酶学工具。
创新点
1. 首次发现II类二萜环化酶在C7亚甲基去质子化生成内环双键（不同于常规的C8外环甲基去质子化）；2. 首次发现I类二萜合酶直接以水取代二磷酸基团生成羟基；3. 仅需单个双功能酶即可合成labda-7,13E-dien-15-ol。
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli C41 | 二萜生物合成途径 | SmCPSKSL1 | SmCPSKSL1（双功能二萜合酶） | 催化 | 催化GGPP进行II类环化生成labda-7,13E-dien-15-yl二磷酸中间体，并经I类反应水解生成labda-7,13E-dien-15-ol |
| Escherichia coli C41 | 类异戊二烯生物合成途径 | — | GGPP合酶（共表达） | 催化 | 提供底物GGPP，用于SmCPSKSL1的催化反应 |
关键发现
- 重组大肠杆菌共表达GGPP合酶时，SmCPSKSL1主要产生labda-7,13E-dien-15-ol（约占总产物的80%）
- 从2L培养物中纯化获得18mg产物
- 体外纯化酶在磷酸酶抑制剂存在下仍能直接生成labda-7,13E-dien-15-ol
- 产物结构经NMR鉴定为labda-7,13E-dien-15-ol，且C9-10取代基为顺式构型。
研究结论
研究表明，S. moellendorffii 的双功能二萜合酶 SmCPSKSL1 能通过新型的II类环化反应（C7去质子化）和I类水解反应，从GGPP直接生成labda-7,13E-dien-15-ol。这不仅定义了一个新的II类反应类型，也提供了I类二萜合酶直接以水取代二磷酸基团的第一个例子。该发现表明，仅单个酶的变异即可实现此类天然产物的生物合成，可能解释了该类化合物在植物中系统发育分散出现的趋同进化机制。