Identification and Characterization of Bacterial Diterpene Cyclases that Synthesize the Cembrane Skeleton
- 作者
- Ayuko Meguro, Takeo Tomita, Makoto Nishiyama, Tomohisa Kuzuyama
- 杂志
- ChemBioChem（2012）
- DOI
- 10.1002/cbic.201200651
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
从链霉菌基因组中挖掘并表征新的细菌二萜环化酶，鉴定合成西松烷骨架的酶。
研究策略
基于二萜环化酶基因常与GGDP合酶基因相邻的特点，对Streptomyces sp. SANK 60404进行基因组测序，以GGDP合酶序列为查询序列，在邻近区域搜索推定萜类合酶，获得两个I类二萜环化酶基因dtcycA和dtcycB，并在大肠杆菌中异源表达、纯化，进行酶学表征和产物结构鉴定。
研究路线图
核心内容
针对细菌二萜环化酶挖掘的难点，该研究提出利用二萜环化酶基因常与GGDP合酶基因相邻的基因组特征，对Streptomyces sp. SANK 60404进行测序，并以GGDP合酶基因为查询序列，在邻近区域鉴定出两个新的I类二萜环化酶基因dtcycA和dtcycB。重组酶在大肠杆菌中异源表达纯化后，以GGDP为底物并在Mg²⁺存在下进行酶学表征。DtcycA催化生成二萜1和2，DtcycB生成2、3及新化合物4，其结构经HRMS和NMR确定。动力学分析显示DtcycA的Km为93.7 μM、kcat为2.8 min⁻¹，DtcycB的Km为42.1 μM、kcat为1.3 min⁻¹。产物均不含二磷酸基团，证实反应由离子化启动。这一邻近基因挖掘策略有效发现了可构建西松烷骨架的新酶，为从公共基因组数据中发掘更多未知二萜环化酶提供了可行途径。
创新点
1. 提出以GGDP合酶基因邻近区域挖掘新型二萜环化酶的策略；2. 发现两个可合成西松烷骨架的新细菌I类二萜环化酶DtcycA和DtcycB；3. 鉴定了一个具有新骨架的二萜化合物4，并确定其绝对构型；4. 提出了DtcycA和DtcycB的离子化依赖环化反应机理。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3) | 异源表达重组蛋白 | dtcycA | DtcycA | 催化 | 重组二萜环化酶，以GGDP为底物生成西松烷类产物1和2 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 异源表达重组蛋白 | dtcycB | DtcycB | 催化 | 重组二萜环化酶，以GGDP为底物生成2、3和新化合物4 |
| Streptomyces sp. SANK 60404 | 二萜前体生物合成 | GGDP合酶基因（未命名，与CotB1同源） | GGDP合酶 | 催化 | 用于基因挖掘的邻近标记基因，其邻近区域存在二萜环化酶基因 |
关键发现
- 从Streptomyces sp. SANK 60404基因组中鉴定出两个新的I类二萜环化酶DtcycA（371 aa）和DtcycB（343 aa），两者均含NSE基序，与CotB2的序列一致性仅14%和19%
- 重组酶在大肠杆菌中表达，SDS-PAGE测定分子量分别为42和38 kDa，凝胶过滤为95和69 kDa，推测为同源二聚体
- 以GGDP为底物且在Mg2+存在下，DtcycA催化生成二萜1和2，DtcycB生成2、3和4，其中4为新化合物（(4E,8E,12E)-2,2,5,9,13-五甲基环十五碳-4,8,12-三烯-1-醇，分子式C20H34O，HRMS m/z 291.2690 [M+H]+）
- 稳态动力学参数：DtcycA的Km=93.7±8.4 μM，kcat=2.8 min−1
- DtcycB的Km=42.1±7.3 μM，kcat=1.3 min−1
- 制备反应中分别获得1（4.0 mg）、2（3.0 mg）（DtcycA），及2（5.0 mg）、3（5.4 mg）、4（2.4 mg）（DtcycB）。这些产物均不含二磷酸基团，表明反应为离子化启动。
研究结论
本研究通过GGDP合酶邻近基因挖掘策略，从Streptomyces sp. SANK 60404中发现了两个新的I类二萜环化酶DtcycA和DtcycB，它们能利用GGDP合成西松烷骨架二萜，其中一个为新化合物。该策略有望用于从公共数据库中挖掘更多未知的二萜环化酶。