Genetic Dissection of Sesquiterpene Biosynthesis by Fusarium fujikuroi
- 作者
- Nelson L. Brock, Kathleen Huss, Bettina Tudzynski, Jeroen S. Dickschat
- 单位
- Technische Universität Braunschweig, Institut für Organische Chemie; Westfälische Wilhelms-Universität Münster, Institut für Botanik
- 杂志
- ChemBioChem（2013）
- DOI
- 10.1002/cbic.201200695
- 所属领域
- 代谢工程 / 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
鉴定水稻病原真菌Fusarium fujikuroi中两个倍半萜环化酶（Ffsc4和Ffsc6）的催化产物，并优化相关倍半萜的生产。
研究策略
通过基因敲除和过表达（gpd启动子驱动）结合顶空挥发物分析（CLSA-GC-MS），对Δffsc4和Δffsc6突变株进行代谢谱比较，构建工程菌株SG139过表达Ffsc6或Ffsc4，纯化主要产物后利用NMR和旋光法进行结构鉴定。
研究路线图
核心内容
该研究对水稻病原真菌Fusarium fujikuroi中两个倍半萜环化酶基因ffsc6和ffsc4进行了功能鉴定与代谢工程优化。通过基因敲除构建Δffsc6和Δffsc4突变株，结合CLSA-GC-MS顶空挥发物分析，确认Ffsc6催化生成(-)-α-acorenol及其侧产物，Ffsc4催化生成koraiol及caryophyllane类化合物。在赤霉素缺陷菌株SG139中利用gpd启动子过表达目标环化酶并敲除另一环化酶基因，获得工程菌株SC6和SC4，其中SC4的koraiol产量较野生型提高约100倍，SC6的α-acorenol产量提高约3倍。从50个琼脂平板中纯化得到15 mg α-acorenol和8 mg koraiol，经NMR和旋光法确认结构，koraiol为具有4-7-4三环骨架的5,8-cyclocaryophyllen-4-ol。该工作首次明确了两基因的催化产物，验证了基于挥发物谱的倍半萜分组归属，同时建立的组合敲除与过表达策略为真菌倍半萜醇的高效制备提供了可行方案。
创新点
首次鉴定了F. fujikuroi中两个倍半萜环化酶Ffsc6和Ffsc4的产物分别为(-)-α-acorenol和koraiol；通过组合敲除和过表达策略构建了高产菌株，其中koraiol产量提高约100倍；建立了基于基因工程的倍半萜醇高效纯化方法。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Fusarium fujikuroi IMI58289 | 倍半萜生物合成途径（甲羟戊酸途径下游） | ffsc6 | Ffsc6（倍半萜环化酶） | 催化 | 基因座位FFUJ_10353，催化FPP环化生成α-acorenol等acorane型倍半萜 |
| Fusarium fujikuroi IMI58289 | 倍半萜生物合成途径（甲羟戊酸途径下游） | ffsc4 | Ffsc4（倍半萜环化酶） | 催化 | 基因座位FFUJ_12585，催化FPP环化生成koraiol等caryophyllane型倍半萜 |
| Fusarium fujikuroi SG139（GA缺陷菌株） | 倍半萜生物合成途径 | ffsc6 | Ffsc6 | 催化 | 过表达菌株SC6（SG139 gpd::ffsc6 Δffsc4），用于生产(-)-α-acorenol |
| Fusarium fujikuroi SG139（GA缺陷菌株） | 倍半萜生物合成途径 | ffsc4 | Ffsc4 | 催化 | 过表达菌株SC4（SG139 gpd::ffsc4 Δffsc6），用于生产koraiol |
关键发现
- Δffsc6突变株丧失α-acorenol(3)及其侧产物产生，Δffsc4突变株丧失koraiol(X)及caryophyllane类化合物产生
- 过表达菌株SC6（SG139 gpd::ffsc6 Δffsc4）中α-acorenol产量提高约3倍，SC4（SG139 gpd::ffsc4 Δffsc6）中koraiol产量提高约100倍
- 从50个琼脂平板中纯化得到15 mg α-acorenol和8 mg koraiol
- α-acorenol比旋光度[α]D^23=-15.5 (c=0.12, CHCl3)，koraiol比旋光度[α]D^23=+32.9 (c=0.08, CHCl3)
- Koraiol经NMR鉴定为具有4-7-4三环骨架的5,8-cyclocaryophyllen-4-ol，与已知化合物koraiol一致。
研究结论
F. fujikuroi中的倍半萜环化酶Ffsc6（FFUJ_10353）和Ffsc4（FFUJ_12585）分别催化生成(-)-α-acorenol和koraiol，并通过基因工程手段成功实现了这两种产物的高效生产，验证了先前基于挥发物谱的倍半萜分组归属。