Characterization of the Gene Cluster CYP264B1-geoA from Sorangium cellulosum So ce56: Biosynthesis of (+)-Eremophilene and Its Hydroxylation
- 作者
- Alexander Schiffrin, Thuy T. B. Ly, Nils Günnewich, Josef Zapp, Verena Thiel, Stefan Schulz, Frank Hannemann, Yogan Khatri, Rita Bernhardt
- 单位
- Universitat des Saarlandes, Biochemie; Institute of Biotechnology, Vietnam Academy of Science and Technology (VAST); Universitat des Saarlandes, Pharmazeutische Biologie; Technische Universitat Braunschweig, Institut für Organische Chemie
- 杂志
- ChemBioChem（2015）
- DOI
- 10.1002/cbic.201402443
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
鉴定并功能表征粘细菌Sorangium cellulosum So ce56中CYP264B1-geoA基因簇的功能，特别是解析geoA合酶的新倍半萜产物及其被CYP264B1羟基化的过程，以阐明细菌萜类生物合成
研究策略
通过生物信息学分析基因簇，在大肠杆菌中异源表达geoA和CYP264B1，利用共表达MVA通路的全细胞转化系统生产产物，综合运用NMR、X射线衍射、GC/MS和旋光度等技术解析产物结构，并通过底物结合和转化实验验证CYP264B1的功能
核心内容
该研究对粘细菌Sorangium cellulosum So ce56中CYP264B1-geoA基因簇进行了功能鉴定，解析了(+)-eremophilene的生物合成及其细胞色素P450氧化修饰过程。研究者通过生物信息学分析定位基因簇，在大肠杆菌中异源表达geoA合酶和CYP264B1，并借助甲羟戊酸途径的共表达实现全细胞转化生产，综合运用NMR、X射线衍射、GC/MS和旋光度等技术确定产物结构。结果显示geoA编码一个(+)-eremophilene合酶，其产物为新倍半萜(+)-eremophilene，旋光度[α]D25=+131.7，产量约19 mg/L/天。CYP264B1对(+)-eremophilene的解离常数Kd为0.40 μM，底物结合引起约99%高自旋位移，体内转化生成至少6种氧化产物，其中最丰富产物分子量为220 Da，推测为单羟基化或环氧化衍生物。在原始菌株细胞提取物中也检测到(+)-eremophilene为最丰富倍半萜之一，证实该基因簇在天然宿主中功能活跃。该研究首次报道(+)-eremophilene合酶，并证明细菌与植物中eremophilene合酶存在对映互补的平行进化，为萜类天然产物的异源生产和P450介导的结构多样化提供了新策略。
创新点
首次鉴定(+)-eremophilene合酶(geoA)及其新产物(+)-eremophilene；完善了eremophilene的NMR信号全归属；证明(+)-eremophilene是CYP264B1的生理底物，揭示其天然氧化产物；建立E. coli全细胞系统实现毫克级产物生产；证明植物中(-)-eremophilene与细菌中(+)-eremophilene的对映互补平行进化
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Sorangium cellulosum So ce56 | 萜类生物合成 | geoA (sce8552) | GeoA | 催化 | (+)-eremophilene合酶，催化FPP环化合成(+)-eremophilene |
| Sorangium cellulosum So ce56 | 萜类生物合成 | CYP264B1 (sce8551) | CYP264B1 | 催化 | 细胞色素P450单加氧酶，羟基化(+)-eremophilene |
| Escherichia coli | 甲羟戊酸途径 | MVA pathway genes (来自Streptomyces sp. CL190) | 甲羟戊酸途径酶 | 催化 | 共表达以供应FPP底物，用于(+)-eremophilene全细胞合成 |
| Escherichia coli | 电子传递链 | fpr, adx | Fpr (ferredoxin reductase), Adx (adrenodoxin) | 能量供给 | 异源电子传递系统，为CYP264B1提供还原力 |
关键发现
- geoA被鉴定为(+)-eremophilene合酶，其产物(+)-eremophilene为首次发现的新倍半萜，旋光度[α]D25=+131.7，产量约19 mg/L/天
- CYP264B1对(+)-eremophilene的解离常数Kd为0.40 μM，底物结合引起约99%高自旋位移
- CYP264B1在体内将(+)-eremophilene转化为至少6种氧化产物，最丰富产物分子量为220 Da（C15H24O），推测为单羟基化或环氧化衍生物
- 在S. cellulosum So ce56细胞提取物中检测到(+)-eremophilene为最丰富的倍半萜之一
- CYP264B1纯化产量为864 nmol/L
研究结论
基因簇CYP264B1-geoA编码一个功能性(+)-eremophilene生物合成与氧化系统：geoA合成(+)-eremophilene，CYP264B1将其羟基化为多种衍生物，表明该基因簇负责(+)-eremophilene衍生物的合成。这是首次报道(+)-eremophilene合酶及其产物，并为细菌与植物中萜类合酶的对映互补平行进化提供了证据