Unusually Broad Substrate Profile of Self-Sufficient Cytochrome P450 Monooxygenase CYP116B4 from Labrenzia aggregata
- 作者
- Yue-Cai Yin, Hui-Lei Yu, Zheng-Jiao Luan, Ren-Jie Li, Peng-Fei Ouyang, Jing Liu, Jian-He Xu
- 单位
- Laboratory of Biocatalysis and Synthetic Biotechnology, State Key Laboratory of Bioreactor Engineering, East China University of Science and Technology; Shanghai Collaborative Innovation Center for Biomanufacturing Technology
- 杂志
- ChemBioChem（2014）
- DOI
- 10.1002/cbic.201402309
- 所属领域
- 生物催化
- 关键词
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解决的核心问题
发现和表征具有新底物特异性的自足型细胞色素P450单加氧酶，特别是能催化非活化C-H键区域和立体选择性羟基化的酶。
研究策略
通过基因组数据挖掘（基于序列同源性搜索）从Labrenzia aggregata中鉴定新的CYP116B亚家族成员P450LAMO；在大肠杆菌中异源表达、纯化、光谱表征；系统研究其底物谱，覆盖磺化、O-脱烷基、羟基化、环氧化等反应。
核心内容
通过基因组数据挖掘，从海洋细菌Labrenzia aggregata IAM 12614中鉴定并表征了一个新的自足型细胞色素P450单加氧酶CYP116B4（P450LAMO），其与已知的P450RHF和P450SMO分别具有60%和62%的序列同源性。该酶在大肠杆菌中异源表达并纯化后，对p-氯硫代苯甲醚的比活力为7.0 U g⁻¹，较粗提物提高3.3倍；以细胞色素c为底物时，偏好NADPH（Km=9.3 μM，kcat=20.6 s⁻¹），最适pH 8.5、温度40°C。底物谱研究揭示其异常广泛的催化能力：在不对称亚砜化中，对乙基苯硫醚转化率达89.5%且ee>99%，对p-氯硫代苯甲醚转化率98.2%且ee 96.1%；在羟基化反应中，乙苯被高对映选择性地转化为(S)-1-苯乙醇（ee 99%），2-氯乙苯生成(R)-2-氯-1-苯乙醇（ee 92.1%），茚满主要生成(S)-茚满-1-醇（占产物90%）；此外还可催化p-硝基苯甲醚的O-脱烷基（100%转化）和β-紫罗兰酮的区域选择性羟基化。该酶在20、30、40°C的半衰期分别为23、15、2小时。这一发现首次在CYP116B亚家族中报道了对非活化C-H键的高对映选择性羟基化，其异常宽泛的底物范围和立体选择性使其成为蛋白质工程改造与合成应用开发的理想模板。
创新点
1. 首次报道来自Labrenzia aggregata的CYP116B4（P450LAMO）作为新的自足型P450单加氧酶；2. 揭示其异常广泛的底物范围，包括多种芳香化合物、双环分子和萜类；3. 首次在CYP116B亚家族中观察到对非活化C-H键的高对映选择性羟基化。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3) | — | — | — | 区室化 | 异源表达宿主 |
| — | 细胞色素P450氧化代谢 | CYP116B4 (gene 4932) | P450LAMO (CYP116B4) | 催化 | 自足型P450单加氧酶，催化羟化、环氧化、O-脱烷基和亚砜化 |
| — | 辅因子再生 | gdh | 葡萄糖脱氢酶 (GDH) | 能量供给 | 来自Bacillus subtilis，用于NADPH再生 |
关键发现
- 通过基因组挖掘发现并鉴定了来自Labrenzia aggregata IAM 12614的自足型P450单加氧酶CYP116B4（P450LAMO），其与P450RHF和P450SMO分别有60%和62%的同源性。纯化后的P450LAMO对p-氯硫代苯甲醚的比活力为7.0 U g^-1，较粗提物提高3.3倍。该酶偏好NADPH（Km=9.3±0.6 μM，kcat=20.6±0.4 s^-1，以细胞色素c为底物），最适pH
- 5，最适温度40°C。底物谱研究表明：在磺化反应中，对乙基苯硫醚（1a）转化率89.5%、ee>99%；对p-氯硫代苯甲醚（1c）转化率98.2%、ee
- 1%；对p-甲氧基硫代苯甲醚（1b）转化率81.9%、ee
- 0%。O-脱烷基反应中，p-硝基苯甲醚100%转化。羟基化反应中，乙苯生成(S)-1-苯乙醇，ee高达99%；2-氯乙苯生成(R)-2-氯-1-苯乙醇，ee
- 1%；丙苯生成(S)-1-苯丙-1-醇（ee
- 3%）和(S)-1-苯丙-2-醇（ee
- 4%）；茚满生成(S)-茚满-1-醇（占产物90%，ee
- 3%）；β-紫罗兰酮区域选择性得到4-羟基-β-紫罗兰酮。酶在20、30、40°C的半衰期分别为23、15、2小时。
研究结论
通过基因组数据挖掘成功发现了一个新的自足型P450单加氧酶P450LAMO，其具有异常广泛的底物谱，能够催化羟基化、环氧化、O-脱烷基、不对称亚砜化等多种氧化反应，尤其对非活化C-H键表现出区域和立体选择性，是定向进化和应用开发的理想模板。