An Improved Technique for the Rapid Chemical Characterisation of Bacterial Terpene Cyclases
- 作者
- Jeroen S. Dickschat, Khomaizon A. K. Pahirulzaman, Patrick Rabe, Tim A. Klapschinski
- 杂志
- ChemBioChem（2014）
- DOI
- 10.1002/cbic.201300763
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
传统细菌萜烯环化酶化学表征流程中，限制性酶切连接克隆步骤繁琐且常需多次尝试，成为快速鉴定的瓶颈；因此需要开发一种更高效的克隆与异源表达方法。
研究策略
构建了兼具酵母和 E. coli 复制/筛选特性的表达载体 pYE-Express（含 2μ 复制起点和 URA3 标记），通过酵母同源重组进行高效基因克隆，随后在大肠杆菌中异源表达，结合 CLSA 顶空取样、GC/MS 分析和体外底物孵育实验，对三种细菌萜烯环化酶进行化学表征。
核心内容
针对传统细菌萜烯环化酶表征中限制性酶切克隆繁琐的瓶颈，本研究构建了兼具酵母和大肠杆菌复制特性的双宿主载体pYE-Express，将酵母2μ复制起点与URA3标记引入pET28c(+)骨架，使得基因克隆可通过酵母同源重组高效完成，随后转入大肠杆菌进行异源表达。结合CLSA顶空取样、GC/MS分析与体外底物孵育，研究人员对三种细菌萜烯环化酶进行了化学表征。结果显示，来自S. espanensis的YP_007039597被证实为石竹烯合酶，仅以FPP生成单一产物石竹烯；而S. spinosa的WP_010314578主要生成(E)-β-法尼烯与hedycaryol，并伴随多达九种副产物；S. roseum的YP_003342315则产生δ-杜松烯和epi-cubebol，且germacradien-4-ol的生成在pH 8.5时显著高于pH 7.0。该工作建立的快速流程可显著加速细菌萜烯环化酶同源基因的功能鉴定，同时提示顶空分析可能因产物挥发性差异导致比例失真。
创新点
1) 构建了 pYE-Express 载体，将酵母 2μ 复制起点和 URA3 标记引入 pET28c(+)，使基因克隆可通过酵母同源重组完成，避免了传统限制性酶切连接步骤；2) 建立从酵母重组克隆到 E. coli 异源表达再到 CLSA-GC/MS 分析的快速表征流程；3) 首次鉴定了三种细菌萜烯环化酶的产物，并发现 hedycaryol 合酶和 epi-cubebol 合酶可产生复杂产物混合物，以及 germacradien-4-ol 的生成具有 pH 依赖性。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli | 倍半萜生物合成 | — | YP_007039597 | 催化 | 来自 Saccharothrix espanensis DSM 44229，证实为石竹烯合酶，以 FPP 为底物生成单一产物石竹烯。 |
| Escherichia coli | 倍半萜生物合成 | — | WP_010314578 | 催化 | 来自 Saccharopolyspora spinosa NRRL 18395，为 hedycaryol 合酶，体外孵育主产物为 hedycaryol（6），顶空主产物为 (E)-β-法尼烯（2），产生多种倍半萜。 |
| Escherichia coli | 萜烯生物合成（倍半萜和单萜） | — | YP_003342315 | 催化 | 来自 Streptosporangium roseum DSM 43021，为 epi-cubebol 合酶，体外孵育主产物为 epi-cubebol（22），顶空倍半萜主产物为 δ-杜松烯（13），单萜主产物为芳樟醇（28）。 |
关键发现
- 从 S. espanensis 的萜烯环化酶（accession YP_007039597）被证实为石竹烯合酶，仅以 FPP 为底物生成单一产物石竹烯；从 S. spinosa 的酶（WP_010314578）在顶空分析中主产物为 (E)-β-法尼烯（2），体外孵育主产物为 hedycaryol（6），并生成 (E,E)-α-法尼烯、橙花叔醇、大牻牛儿烯 A、hedycaryol、大牻牛儿烯 D、双环大牻牛儿烯、allo-hedycaryol、viridiflorol、avermitilol 等；该酶与 S. avermitilis 的 avermitilol 合酶仅有 27% 氨基酸同一性（与 pentalenene 合酶为 33%）。从 S. roseum 的酶（YP_003342315）在顶空分析中倍半萜主产物为 δ-杜松烯（13），体外孵育主产物为 epi-cubebol（22），单萜主产物为芳樟醇（28）；germacradien-4-ol（12）的生成在 pH
- 5 时显著高于 pH
- 0 和 pH
- 0。此外，pYE-Express 载体构建成功。
研究结论
本研究开发了一种基于酵母同源重组克隆和 E. coli 异源表达的快速化学表征方法，成功解析了三种细菌萜烯环化酶的功能。结果表明，CLSA 顶空技术可能因产物挥发性差异导致产物比例失真，尤其在产物复杂时；pH 对某些产物的生成有显著影响。该方法可加速对日益增长的细菌萜烯环化酶同源基因的功能鉴定。