Biochemical Investigations of Two 6-DMATS Enzymes from Streptomyces Reveal New Features of L-Tryptophan Prenyltransferases
- 作者
- Julia Winkelblech, Shu-Ming Li
- 杂志
- ChemBioChem（2014）
- DOI
- 10.1002/cbic.201400046
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
鉴定两个链霉菌来源的推定异戊烯基转移酶SAML0654和Strvi8510的生化功能，并阐明其底物特异性。
研究策略
基因克隆、异源表达、蛋白纯化、体外酶活检测、产物分离与结构鉴定（MS/NMR）、动力学参数测定。
研究路线图
核心内容
该研究通过基因克隆、异源表达与体外酶活检测，鉴定了链霉菌来源的SAMl0654和Strvi8510两个推定异戊烯基转移酶的生化功能。尽管SAMl0654与已知5-DMATS SCO7467序列一致性更高，实验证明二者均为6-二甲基烯丙基色氨酸合酶，分别命名为6-DMATSsa和6-DMATSsv。以L-色氨酸和DMAPP为底物时，两酶产物产率分别为59.4%和42.2%，L-色氨酸为最佳底物，Km为0.018 mM，催化效率达16.67 s⁻¹ mM⁻¹。研究发现多个新特征：两酶对D-色氨酸的相对活性为73.5%和60.7%，远超已知酶；首次发现该家族酶可接受GPP作为供体，尽管其kcat远低于DMAPP；两酶还能异戊烯化羟基萘底物，且SAMl0654对1,3-二羟基萘转化率高达61.5%，异戊烯化发生在未取代苯环上，这在DMATS超家族中属首次报道。这些发现拓展了对细菌吲哚异戊烯基转移酶底物谱和催化机制的认识，为蛋白质结晶与结构研究提供了理想候选酶。
创新点
['尽管SAML0654与5-DMATS SCO7467序列一致性更高（75%），但实验证明其为6-DMATS。', '首次发现色氨酸异戊烯基转移酶可接受GPP作为异戊烯基供体。', '首次报道细菌吲哚异戊烯基转移酶能接受羟基萘作为底物。', '发现对羟基萘的异戊烯化发生在未取代的苯环上，这在DMATS超家族和NphB/CloQ家族中均属首次。']
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli M15 | 色氨酸异戊烯化 | SAML0654 | 6-DMATSsa | 催化 | 催化L-色氨酸及衍生物在C-6位进行异戊烯化，也接受GPP作为供体，并催化羟基萘的异戊烯化。 |
| Escherichia coli BL21(DE3) pLysS | 色氨酸异戊烯化 | Strvi8510 | 6-DMATSsv | 催化 | 催化L-色氨酸及衍生物在C-6位进行异戊烯化，对DMAPP专一性较高，对GPP活性较低。 |
关键发现
- SAML0654和Strvi8510被鉴定为6-二甲基烯丙基色氨酸合酶（6-DMATS），二者序列一致性为63%。以L-色氨酸和DMAPP为底物时，SAML0654和Strvi8510的产物产率分别为59.4%和42.2%。L-色氨酸是最佳底物，Km=0.018 mM，kcat=0.30 s⁻¹，催化效率16.67 s⁻¹ mM⁻¹。D-色氨酸的相对活性分别为73.5%和60.7%，远高于已知酶（FgaPT2为1.8%，lptA为4.3%，7-DMATS为15.5%）。4-、5-、6-、7-甲基-DL-色氨酸的相对活性分别为96.4%、87.9%、72.2%和51.3%。GPP作为供体时，SAML0654对L-色氨酸、L-abrine和5-甲基色氨酸的转化率分别为26.45%、10.8%和21.6%，相对活性为46.2%、18.8%和37.8%
- Strvi8510对L-色氨酸和5-甲基色氨酸的相对活性仅3.7%和6.2%。动力学参数显示GPP的Km为0.070 mM，略低于DMAPP的0.095 mM，但kcat仅为0.043 s⁻¹，远低于DMAPP的0.63 s⁻¹。在羟基萘底物中，SAML0654对1,3-二羟基萘、1,7-二羟基萘和2,3-二羟基萘的转化率分别为61.5%、33.7%和43.8%
- Strvi8510对1,3-二羟基萘和2,3-二羟基萘的转化率分别为66%和14%，对2,7-二羟基萘为42.1%。金属离子实验表明Mg²⁺和Ca²⁺不影响活性，Cu²⁺、Zn²⁺和Ni²⁺强烈抑制。
研究结论
SAML0654和Strvi8510被鉴定为6-DMATS，并命名为6-DMATSsa和6-DMATSsv。它们表现出若干新的生化特征，包括对GPP的接受、对D-色氨酸和甲基色氨酸的高活性以及对羟基萘的独特异戊烯化位置，极大扩展了对细菌吲哚异戊烯基转移酶的认识，是进一步蛋白质结晶和结构研究的理想候选酶。