An Engineered Old Yellow Enzyme that Enables Efficient Synthesis of (4R,6R)-Actinol in a One-Pot Reduction System
- 作者
- Shoichiro Horita, Michihiko Kataoka, Nahoko Kitamura, Takuya Nakagawa, Takuya Miyakawa, Jun Ohtsuka, Koji Nagata, Sakayu Shimizu, Masaru Tanokura
- DOI
- 10.1002/cbic.201402555
- 所属领域
- 代谢工程 / 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
野生型 CmOYE 对中间体 (4S)-phenol 的催化活性低，导致一锅两步还原合成 (4R,6R)-actinol 时中间体积累，产物收率仅 67.2%。
研究策略
解析 CmOYE 及其与底物类似物 p-HBA 复合物的晶体结构，识别底物识别环（loop 6），通过定点突变（如 P295G）扩大底物谱，并与 LVR 联用提高一锅两步转化效率。
研究路线图
核心内容
本研究针对野生型CmOYE在催化中间体(4S)-phenol时活性低、导致一锅两步还原合成(4R,6R)-actinol收率受限的问题，通过结构生物学手段与定点突变策略加以解决。作者解析了CmOYE及其与底物类似物p-HBA的复合物晶体结构（分辨率1.8 Å），发现底物识别环loop 6在无底物时呈开放构象、结合底物后转为闭合，揭示了其作为底物过滤器的作用。基于此，设计并构建了单点突变体P295G，该突变对ketoisophorone和(4S)-phenol的催化活性分别为野生型的2倍和12倍。在与(6R)-levodione还原酶LVR联用的一锅两步转化体系中，CmOYE(P295G)将(4R,6R)-actinol的收率从野生型的67.2%提高至90.1%，同时中间体(4S)-phenol积累量由28.1%降至9.1%。该结果表明，通过结构指导的loop 6突变可有效重塑OYE的底物特异性和催化效率，为进一步开发高效OYE类生物催化剂提供了可行策略。
创新点
确定了 CmOYE loop 6 的开放/闭合两种构象，揭示其作为底物过滤器的作用；通过结构指导的单点突变 P295G 将 (4S)-phenol 的活性提高 12 倍，一锅两步转化产率从 67.2% 提高到 90.1%。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3) | 酮异佛尔酮→(6R)-levodione | CmOYE | CmOYE（野生型） | 催化 | 作为表达宿主，实际催化在无细胞体系中进行 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | (6R)-levodione→(4R,6R)-actinol | LVR | (6R)-levodione reductase | 催化 | 来自 Corynebacterium aquaticum M-13，在大肠杆菌中表达 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 酮异佛尔酮→(6R)-levodione及(4S)-phenol→(4R,6R)-actinol | CmOYE(P295G) | CmOYE P295G 突变体 | 催化 | 通过结构指导设计的 loop 6 突变体 |
关键发现
- CmOYE 与底物类似物 p-HBA 复合物晶体结构分辨率为
- 8 Å（PDB: 4TMB/4TMC）；loop 6 在无底物时呈开放构象，结合底物后呈闭合；P295G 对 ketoisophorone 和 (4S)-phenol 的催化活性分别为野生型的 2 倍和 12 倍；一锅两步转化中，CmOYE(P295G)+LVR 使 (4R,6R)-actinol 收率达到
- 1%，(4S)-phenol 积累降至
- 1%（野生型分别为
- 2% 和
- 1%）。
研究结论
通过结构指导的 loop 6 突变可以改变 CmOYE 的底物特异性和催化效率，为开发新型 OYE 生物催化剂提供了策略。