New Sesquiterpene Oxidations with CYP260A1 and CYP264B1 from Sorangium cellulosum Soc56
- 作者
- Alexander Schiffrin, Martin Litzenburger, Michael Ringle, Thuy T. B. Ly, Rita Bernhardt
- 杂志
- ChemBioChem（2015）
- DOI
- 10.1002/cbic.201500417
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
细菌P450对倍半萜衍生化的潜力尚未被充分研究；本文旨在比较CYP260A1和CYP264B1对不同结构倍半萜的底物特异性和区域选择性，拓展细菌P450在倍半萜选择性氧化中的应用。
研究策略
利用大肠杆菌全细胞生物催化系统，以四类倍半萜（eremophilanes、humulanes、caryophyllanes和cedranes）为底物，通过GC/MS和NMR鉴定产物，系统比较CYP260A1与CYP264B1的转化率、产物分布和区域选择性。
核心内容
该研究利用大肠杆菌全细胞生物催化系统，系统比较了源自黏细菌Sorangium cellulosum Soc56的两种细胞色素P450酶CYP260A1和CYP264B1对四类倍半萜（eremophilanes、humulanes、caryophyllanes和cedranes）的氧化能力。实验采用GC/MS和NMR鉴定产物，考察了不同底物的转化率、产物分布与区域选择性。结果表明，CYP260A1能羟基化化学惰性的C-H键，例如氧化(+)-nootkatone时消耗62%底物，主产物4-hydroxynootkatone选择性达61%，且能完全转化zerumbone和(+)-3(15)-cedren-4-ol；但对不含氧的倍半萜烃类底物无活性。相比之下，CYP264B1是高度选择性的烯丙位羟基化酶，对(+)-nootkatone转化率97%，对zerumbone转化率100%且5-hydroxyzerumbone选择性高达96%，对α-humulene的5-hydroxyhumulene选择性90%，且对含酮底物的转化率和选择性普遍优于相应烃类底物。该研究揭示两种P450酶在倍半萜选择性衍生化中具有互补优势，为药物和香料合成提供了有价值的生物催化工具。
创新点
首次系统比较黏细菌Sorangium cellulosum Soc56来源的CYP260A1和CYP264B1对多种倍半萜的氧化能力；发现CYP260A1能羟基化化学惰性的C-H键（如(+)-nootkatone的C-4和(+)-3(15)-cedren-4-ol的C-9）；发现CYP264B1是高度选择性的烯丙位羟基化酶，能高效转化多种倍半萜；获得了多个新氧化产物如(4S)-hydroxynootkatone、5-hydroxyzerumbone等。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3) | 倍半萜氧化 | CYP260A1 | CYP260A1 | 催化 | 氧化含氧倍半萜，如(+)-nootkatone羟化于C-4，zerumbone多氧化，(+)-3(15)-cedren-4-ol羟化于C-9 |
| Escherichia coli C43(DE3) | 倍半萜氧化 | CYP264B1 | CYP264B1 | 催化 | 选择性烯丙位羟基化，如zerumbone C-5、α-humulene C-5、β-caryophyllene C-5、(+)-nootkatone C-13、(+)-valencene C-13、α-cedrene C-15 |
| Escherichia coli | 电子传递 | fpr | Fpr | 能量供给 | 铁氧还蛋白还原酶，为P450提供电子 |
| Escherichia coli | 电子传递 | adx4-108 | Adx4-108 | 能量供给 | 铁氧还蛋白，为P450提供电子 |
关键发现
- CYP260A1氧化(+)-nootkatone时62%底物被消耗，主产物4-hydroxynootkatone选择性61%
- zerumbone被100%转化为4个产物（7-10）
- (+)-3(15)-cedren-4-ol被100%转化为4个产物（17-20）
- 不含氧的倍半萜烃（(+)-valencene、α-humulene、β-caryophyllene、α-cedrene）不被CYP260A1氧化。CYP264B1对(+)-nootkatone转化率为97%（主产物13-hydroxynootkatone与另一产物合计84%）
- 对(+)-valencene转化率为76%，生成15个产物，13-hydroxyvalencene选择性58%
- 对zerumbone转化率为100%，5-hydroxyzerumbone选择性96%
- 对α-humulene转化率为58%，5-hydroxyhumulene选择性90%
- 对β-caryophyllene生成5-hydroxycaryophyllene的选择性为83%
- 对α-cedrene生成15-hydroxy-3(4)-cedrene。CYP264B1对含酮底物（如1和6）的转化率和选择性高于对应的烃类底物（如4和12）。
研究结论
CYP260A1和CYP264B1是通用性倍半萜氧化酶，能转化多种结构类型的倍半萜。CYP264B1是高度选择性的烯丙位羟基化酶，而CYP260A1可羟基化化学惰性碳原子，但产物多样性较高，可通过蛋白质工程提高其选择性。两者在倍半萜选择性衍生化以及药物、香料等领域具有应用潜力。