Biosynthesis of Sesterterpene, Head- to- tail Triterpene, and Sesquarterpene in Bacillus clausii: Identification of Multifunctional Enzymes and Analysis of Isoprenoid Metabolites
- 作者
- Daijiro Ueda, Hiroaki Yamaga, Mizuki Murakami, Yusuke Totsuka, Tetsuro Shinada, Tsutomu Sato
- 杂志
- ChemBioChem（2015）
- DOI
- 10.1002/cbic.201500138
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
阐明Bacillus clausii中罕见萜类（二倍半萜、头尾三萜和倍半萜）的生物合成途径，并鉴定参与其中的多功能酶及异戊二烯代谢产物。
研究策略
克隆表达B. clausii中的多个E-IDS同源物并进行体外酶活分析，同时结合体内代谢产物分析（GC-MS、LC-MS等），鉴定新化合物和甲萘醌产物，明确各酶的功能。
研究路线图
核心内容
该研究以 Bacillus clausii 为对象，系统阐明了其罕见萜类（二倍半萜、头尾三萜和倍半萜）的生物合成途径。通过克隆表达多个 E-IDS 同源物并进行体外酶活分析，结合体内代谢物鉴定，发现 E-IDS1 是首次在细菌中报道的双功能 FPP/GGPP 合酶，催化 DMAPP 生成 FPP 和 GGPP；E-IDS2-S/L 异源二聚体被鉴定为三功能 GFPP/HexPP/HepPP 合酶，可利用 DMAPP、FPP 或 GGPP 分别合成相应产物；Bcl-TS 则被重新定义为三功能二倍半萜/三萜/倍半萜合酶，可分别以 GFPP、HexPP 和 HepPP 为底物生成化合物 1、2 和新化合物 3（β-heptaprene，C35H56）。1、2、3 的产量分别为 0.96、0.66 和 0.065 mg/g 细胞干重，比例约 57:39:4。此外，MK-6 和 MK-7 产量分别为 0.035 和 0.365 mg/g 细胞干重。结果表明 GFPP/HexPP 主要参与无环萜烯合成，而 HepPP 主要用于甲萘醌-7 合成。该发现为萜类多样性研究和新型萜烯挖掘提供了重要酶学基础。
创新点
首次鉴定三功能GFPP/HexPP/HepPP合酶（E-IDS2-S/L）；将Bcl-TS重新定义为三功能二倍半萜/三萜/倍半萜合酶；首次报道细菌中的双功能FPP/GGPP合酶（E-IDS1）；发现并鉴定新化合物β-heptaprene（3）。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Bacillus clausii | 类异戊二烯生物合成途径 | e-ids1 | E-IDS1 | 催化 | 双功能FPP/GGPP合酶，细菌中首次报道 |
| Bacillus clausii | 类异戊二烯生物合成途径 | e-ids2-s | E-IDS2-S | 催化 | 异源二聚体小亚基，与E-IDS2-L共同形成三功能GFPP/HexPP/HepPP合酶；单独无活性 |
| Bacillus clausii | 类异戊二烯生物合成途径 | e-ids2-l | E-IDS2-L | 催化 | 异源二聚体大亚基，与E-IDS2-S共同形成三功能GFPP/HexPP/HepPP合酶；单独无活性 |
| Bacillus clausii | 萜烯生物合成途径 | — | Bcl-TS | 催化 | 三功能二倍半萜/三萜/倍半萜合酶，可利用GFPP、HexPP和HepPP生成相应无环萜烯 |
关键发现
['E-IDS1催化DMAPP生成FPP和GGPP，为细菌中首次报道的双功能FPP/GGPP合酶。', 'E-IDS2-S/L（异源二聚体）催化DMAPP、FPP或GGPP生成GFPP、HexPP和HepPP，鉴定为三功能GFPP/HexPP/HepPP合酶。', 'Bcl-TS可利用GFPP、HexPP和HepPP分别生成1、2和3，是三功能二倍半萜/三萜/倍半萜合酶。', '化合物1、2、3的产量分别为0.96、0.66和0.065 mg/g细胞干重，比例为57:39:4。', 'MK-6和MK-7产量分别为0.035和0.365 mg/g细胞干重，MK-5未检测到，比例为0:9:91。', 'MK-7产量约为3的5.6倍。', '新化合物3（β-heptaprene）分子式为C35H56，通过NMR和HR-EI-MS确定结构。', '体外实验表明Bcl-TS可将化学合成的HepPP转化为3。']
研究结论
在B. clausii中，Bcl-TS、E-IDS1和E-IDS2-S/L分别被鉴定为三功能二倍半萜/三萜/倍半萜合酶、双功能FPP/GGPP合酶和三功能GFPP/HexPP/HepPP合酶；GFPP/HexPP主要参与无环萜烯的生物合成，而HepPP主要用于甲萘醌-7的合成。该研究为发现新型二倍半萜、头尾三萜和倍半萜提供了基础。