N-Glycosylation with Synthetic Undecaprenyl Pyrophosphate-Linked Oligosaccharide to Oligopeptides by PglB Oligosaccharyltransferase from Campylobacter jejuni
- 作者
- Akihiro Ishiwata, Yuya Taguchi, Yong Joo Lee, Taisuke Watanabe, Daisuke Kohda, Yukishige Ito
- 杂志
- ChemBioChem（2015）
- DOI
- 10.1002/cbic.201402658
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
探究空肠弯曲菌PglB寡糖转移酶对合成脂联寡糖底物的识别与转移，明确其对天然和非天然寡糖的底物特异性。
研究策略
化学合成单糖(Bac1)、三糖(GalNAc2Bac1)和七糖(Glc1GalNAc2Bac1)的十一异戊二烯焦磷酸衍生物，与荧光标记的含共有序列肽段进行体外PglB催化反应，结合动力学分析和质谱鉴定产物。
研究路线图
核心内容
该研究通过化学合成空肠弯曲菌N-糖基化途径中的天然生物合成中间体——单糖（Bac1）、三糖（GalNAc2Bac1）和七糖（Glc1GalNAc2Bac1）的十一异戊二烯焦磷酸衍生物，以及非天然的壳四糖衍生物，在体外系统考察了PglB寡糖转移酶对不同长度脂联寡糖底物的识别与转移能力。研究发现，PglB能够有效将单糖和三糖供体转移至含共有序列的荧光标记肽段上：三糖供体对BODIPY肽的Km为17±6 μM，单糖供体对TAMRA肽的Km为21±3 μM、Vmax为42±1 nm/min，且三糖供体的最大反应速率约为单糖供体的4倍，但高浓度下表现出明显的底物抑制。七糖供体也能被转移但效率较低，而壳四糖完全不被识别。所有糖基化产物均经ESI-TOF质谱确证。这些结果表明PglB对聚异戊二烯焦磷酸寡糖供体具有宽松的糖特异性，其体内精确的七糖修饰并非完全由PglB本身的严格底物选择决定，而是依赖膜区室化和PglK翻转酶的协同选择，为理解细菌N-糖基化的底物选择性机制提供了定量依据。
创新点
首次使用化学合成的生物合成中间体作为底物，定量表征PglB对Bac1和GalNAc2Bac1的转移活性，并发现非天然壳四糖不能被PglB识别。
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli | 重组表达 | pglB | PglB | 催化 | 来自空肠弯曲菌的全长PglB在E. coli中表达，膜组分用于体外寡糖转移反应 |
| Campylobacter jejuni | N-糖基化生物合成 | pglC | PglC | 催化 | 催化UDP-Bac的Bac转移至十一异戊二烯磷酸(Und-P)，生成Und-PP-Bac1 |
| Campylobacter jejuni | N-糖基化生物合成 | pglA | PglA | 催化 | 催化UDP-GalNAc的GalNAc转移至Und-PP-Bac1 |
| Campylobacter jejuni | N-糖基化生物合成 | pglJ | PglJ | 催化 | 参与延伸GalNAc残基形成三糖 |
| Campylobacter jejuni | N-糖基化生物合成 | pglH | PglH | 催化 | 参与延伸GalNAc残基形成六糖 |
| Campylobacter jejuni | N-糖基化生物合成 | pglI | PglI | 催化 | 催化UDP-Glc的β-Glc转移，完成七糖合成 |
| Campylobacter jejuni | N-糖基化生物合成 | pglK | PglK | 转运 | 推测为翻转酶，介导脂联寡糖从细胞质侧转运至周质侧 |
关键发现
- PglB可转移Bac1和GalNAc2Bac1至共有序列肽段：BODIPY肽5的Km为17±6 μM（三糖供体）
- TAMRA肽6对Bac1供体Km=21±3 μM、Vmax=42±1 nm/min
- 对三糖供体Km=38±5 μM（低浓度区），且Vmax约为Bac1的4倍。三糖供体在高浓度下呈现底物抑制（对5: Km=60±67 μM, Ki=65±93 μM
- 对6: Km=75±28 μM, Ki=130±53 μM）。七糖供体也能转移但效率较低。壳四糖供体4未被识别。产物10、12、13经ESI-TOF MS确认（如10的m/z 592.9688
- 12的728.3493
- 13的985.4308）。
研究结论
PglB对聚异戊二烯焦磷酸寡糖供体具有宽松的糖特异性，能接受合成中间体Bac1和GalNAc2Bac1，但不能接受非天然壳四糖，表明体内N-糖基化的精确七糖修饰依赖膜区室化和PglK翻转酶的底物选择。