Identification of a New Diterpene Biosynthetic Gene Cluster that Produces O-Methylkolavelool in Herpetosiphon aurantiacus
- 作者
- Chiaki Nakano, Misaki Oshima, Nodoka Kurashima, Tsutomu Hoshino
- 杂志
- ChemBioChem（2015）
- DOI
- 10.1002/cbic.201402652
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
细菌中二萜类化合物稀少，需要发现和鉴定细菌来源的新二萜生物合成基因簇及其产物。
研究策略
通过BLAST同源比对，在Herpetosiphon aurantiacus基因组中找到与结核分枝杆菌二萜环化酶Rv3377c和合酶Rv3378c同源的基因簇（Haur_2145-Haur_2147），在大肠杆菌中异源表达三个基因，通过体外酶活实验解析各步催化功能，并在H. aurantiacus细胞中验证体内产物。
核心内容
该研究通过BLAST同源比对，在橙色滑柱菌（Herpetosiphon aurantiacus）基因组中发现了一个与结核分枝杆菌二萜环化酶Rv3377c和合酶Rv3378c同源的新基因簇（Haur_2145–Haur_2147），并在大肠杆菌BL21(DE3)中异源表达这三个基因以解析其功能。体外酶活实验表明，Haur_2145是首个被鉴定的kolavenyl diphosphate合酶，可将香叶基香叶基焦磷酸（GGPP）转化为(+)-kolavenyl diphosphate；Haur_2146随后将其水解为(+)-kolavelool；Haur_2147则是首个催化该底物侧链羟基甲基化的S-腺苷甲硫氨酸依赖型O-甲基转移酶，最终生成(+)-O-甲基kolavelool。从10 mg GGPP出发经三步酶促反应可获得2.2 mg (+)-kolavenol，终产物的分子式为C21H36O。在H. aurantiacus细胞提取物中也检测到了该终产物，证实此基因簇在体内具有功能。该工作首次从自然界鉴定了(+)-O-甲基kolavelool及其完整的生物合成基因簇，为细菌来源二萜化合物的发掘与异源合成提供了新的酶学工具和途径参考。
创新点
首次鉴定(+)-O-甲基kolavelool及其生物合成基因簇；Haur_2145是第一个被鉴定的kolavenyl diphosphate合酶；Haur_2147是第一个催化3-甲基戊-1-烯-3-醇侧链羟基甲基化的O-甲基转移酶；该基因簇是细菌中罕见的二萜生物合成基因簇。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3) | 二萜生物合成 | Haur_2145 | Haur_2145 (class II diterpene cyclase) | 催化 | 催化GGPP (1) 环化生成(+)-kolavenyl diphosphate (8) |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 二萜生物合成 | Haur_2146 | Haur_2146 (diterpene synthase) | 催化 | 催化(+)-kolavenyl diphosphate (8) 水解生成(+)-kolavelool (9) |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 二萜生物合成 | Haur_2147 | Haur_2147 (O-methyltransferase) | 催化 | 以SAM为甲基供体，催化(+)-kolavelool (9) 甲基化生成(+)-O-methylkolavelool (11) |
关键发现
- Haur_2145与Rv3377c氨基酸序列同一性为29%，含有DxDD motif（311-314位DGDD）
- Haur_2146与Rv3378c同一性为25%
- Haur_2147为SAM依赖的O-甲基转移酶。体外实验表明，从10 mg GGPP（1）经Haur_2145催化后酸磷酸酶处理得到2.2 mg (+)-kolavenol (6)，比旋光度[α]D20=+51.9 (c=0.20, CHCl3)
- Haur_2145的天然酶产物为(+)-kolavenyl diphosphate (8)。Haur_2146催化8转化为(+)-kolavelool (9)，比旋光度[α]D18=+22.4 (c=0.03, CHCl3)。Haur_2147利用SAM将9甲基化为(+)-O-methylkolavelool (11)，比旋光度[α]D20=+102.3 (c=0.02, CHCl3)，分子式C21H36O。在H. aurantiacus细胞提取物中检测到11，证明该基因簇在体内具有功能。
研究结论
在Herpetosiphon aurantiacus中鉴定了一个由Haur_2145（二萜环化酶）、Haur_2146（二萜合酶）和Haur_2147（O-甲基转移酶）组成的新二萜生物合成基因簇，负责合成(+)-O-甲基kolavelool (11)。这是首次从自然界发现(+)-O-甲基kolavelool及其生物合成基因簇。