Onocerin Biosynthesis Requires Two Highly Dedicated Triterpene Cyclases in a Fern Lycopodium clavatum
- 作者
- Takeshi Araki, Yusuke Saga, Momo Marugami, Junnosuke Otaka, Hiroshi Araya, Kazuki Saito, Mami Yamazaki, Hideyuki Suzuki, Tetsuo Kushiro
- 杂志
- ChemBioChem（2016）
- DOI
- 10.1002/cbic.201500663
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
长链三萜onocerin的生物合成酶长期未知，需要克隆和鉴定催化双端环化反应的关键酶
研究策略
从石松Lycopodium clavatum中克隆氧化角鲨烯环化酶（OSC）候选基因，利用酵母异源表达和产物分析鉴定酶功能，并结合RNAseq发现新基因LCD
研究路线图
核心内容
该研究从石松中克隆了三个氧化角鲨烯环化酶候选基因LCA、LCB和LCC，其中LCA和LCB与环阿屯醇合酶具有65%至77%的氨基酸序列同一性，而LCC与环阿屯醇合酶仅有55%同源性。通过酵母异源表达和产物分析，LCC被鉴定为第一个双环氧角鲨烯环化酶，专一催化2,3;22,23-双环氧角鲨烯生成pre-α-onocerin。进一步利用RNAseq数据发现新基因LCD，与LCC有50%同源性，专一催化pre-α-onocerin生成α-onocerin。在酵母GIL77中单独表达LCC仅产生中间产物，单独表达LCD无产物，而共表达LCC和LCD则成功合成α-onocerin，并经4升大规模培养和NMR确认。该研究首次在基因水平阐明onocerin生物合成需要两个高度专一的酶协同完成双端环化，为长链三萜的酶法合成提供了新途径。
创新点
首次鉴定出两个高度专一的氧化角鲨烯环化酶：LCC（第一个双环氧角鲨烯环化酶）和LCD（只接受部分环化中间体的α-onocerin合酶）；首次实现α-onocerin在酵母中的酶法合成
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae GIL77 | 三萜生物合成 | LCC | LCC (dioxidosqualene cyclase) | 催化 | 专一催化2,3;22,23-双环氧角鲨烯(4)生成pre-α-onocerin(5) |
| Saccharomyces cerevisiae GIL77 | 三萜生物合成 | LCD | LCD (α-onocerin synthase) | 催化 | 专一催化pre-α-onocerin(5)生成α-onocerin(2) |
| Saccharomyces cerevisiae GIL77 | 甾醇/环阿屯醇生物合成 | LCA | LCA (cycloartenol synthase) | 催化 | 催化2,3-氧化角鲨烯生成环阿屯醇 |
| Saccharomyces cerevisiae GIL77 | 甾醇/环阿屯醇生物合成 | LCB | LCB (cycloartenol synthase) | 催化 | 与LCA同源，推测催化环阿屯醇生成 |
关键发现
- 从石松中克隆了LCA、LCB、LCC三个OSC基因，其中LCA和LCB与环阿屯醇合酶有65-77%的氨基酸序列同一性
- LCC与CAS有55%同源性，被鉴定为第一个双环氧角鲨烯环化酶，专一催化2,3
- 22,23-双环氧角鲨烯(4)生成pre-α-onocerin(5)，结构为polypodazo(26),13,17-trien-21,22-epoxy-3β-ol。另从RNAseq数据发现LCD，与LCC有50%同源性，专一催化5生成α-onocerin(2)。在酵母GIL77中单独表达LCC仅产生5，单独表达LCD无产物，共表达LCC和LCD可成功合成α-onocerin，并经4L大规模培养和NMR确认。
研究结论
研究揭示了onocerin生物合成需要两个高度专一的OSC酶LCC和LCD，分别催化双环氧角鲨烯两端的环化形成两个双环结构；这是首次在基因水平阐明onocerin的生物合成。