Biosynthesis of LL-Z1272β: Discovery of a New Member of NRPS-like Enzymes for Aryl-Aldehyde Formation
- 作者
- Chang Li, Yudai Matsuda, Hao Gao, Dan Hu, Xin Sheng Yao, Ikuro Abe
- 杂志
- ChemBioChem（2016）
- DOI
- 10.1002/cbic.201600087
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
LL-Z1272β（1）是真菌meroterpenoids生物合成中的关键途径中间体，但其生物合成基因簇及芳香醛形成的分子机制此前尚未阐明。
研究策略
对产1的湿地真菌Stachybotrys bisbyi PYH05-7进行全基因组测序，鉴定推定基因簇stb；通过在米曲霉NSAR1中异源表达stb基因，结合代谢产物分离、NMR和MS分析，逐步解析各酶功能，最终重构完整生物合成途径。
研究路线图
核心内容
本研究对产LL-Z1272β的湿地真菌Stachybotrys bisbyi PYH05-7进行全基因组测序，鉴定了推定生物合成基因簇stb，并通过在米曲霉NSAR1中逐步异源表达stbA、stbB和stbC，结合代谢产物分离与NMR/MS分析，完整重构了LL-Z1272β的生物合成途径。研究发现，衣草酸先经UbiA-like异戊烯基转移酶StbC法尼基化生成girfolic acid，再由新发现的NRPS-like酶StbB（含A-ACP-R结构域）催化羧酸还原为芳香醛。StbB的腺苷化结构域首次被证实能以法尼基化芳香酸为底物，且不接受未法尼基化的衣草酸，而已知同类酶ATEG_03630则相反；序列比较揭示StbB中L334和H358是关键差异残基，其中H358A突变可改变ATEG_03630的底物特异性。异源表达最终获得LL-Z1272β产量13.0 mg/L培养物。该工作阐明了一种新的芳香醛形成机制，扩展了NRPS-like酶的底物谱，为NRPS工程改造提供了新靶点。
创新点
发现了新的NRPS-like酶StbB（A-ACP-R结构域），其腺苷化结构域首次被报道能以法尼基化芳香酸为底物催化羧酸还原生成芳香醛；揭示了StbB与已知同类酶ATEG_03630底物特异性差异的关键残基位点（L334/H358 vs G/F）。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Stachybotrys bisbyi PYH05-7 | LL-Z1272β生物合成 | stbA | StbA | 催化 | 聚酮合酶（非还原型PKS），合成衣草酸（即2） |
| Stachybotrys bisbyi PYH05-7 | LL-Z1272β生物合成 | stbC | StbC | 催化 | UbiA-like异戊烯基转移酶，催化衣草酸（2）的法尼基化生成girfolic acid（3） |
| Stachybotrys bisbyi PYH05-7 | LL-Z1272β生物合成 | stbB | StbB | 催化 | NRPS-like酶（A-ACP-R结构域），催化法尼基化芳香酸（3）的羧酸还原生成醛，是首个报道能激活法尼基化底物的A结构域 |
| Aspergillus oryzae NSAR1 | LL-Z1272β生物合成（异源表达验证） | stbA; stbB; stbC | StbA; StbB; StbC | 催化 | 在米曲霉中异源共表达三基因，实现LL-Z1272β（1）的从头生物合成（产量13.0 mg/L） |
关键发现
- 从Stachybotrys bisbyi PYH05-7中分离得到LL-Z1272β（1），产量为10.3 mg/kg大米培养基
- 异源表达stbA产生衣草酸（2）
- 共表达stbA和stbC产生法尼基化衣草酸即girfolic acid（3）
- 共表达stbA、stbB、stbC产生LL-Z1272β（1），产量为13.0 mg/L培养物
- StbB只接受法尼基化底物（3）而不接受衣草酸（2），而已知酶ATEG_03630可接受衣草酸
- 序列比较发现StbB中L334和H358分别被G和F替代，ATEG_03630的H358A突变会改变其底物特异性。
研究结论
本研究首次阐明了LL-Z1272β（1）的完整生物合成途径：衣草酸经UbiA-like异戊烯基转移酶StbC法尼基化后，由NRPS-like酶StbB将羧酸还原为醛基；StbB属于subtype II NRPS-like蛋白，代表了一类新的芳香醛形成酶，其A结构域能激活法尼基化分子，扩展了NRPS工程的应用潜力。