高级醇 · 代谢工程文献库

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Discovery of New Biocatalysts for the Glycosylation of Terpenoid Scaffolds

作者
Lorenzo Caputi, Eng-Kiat Lim, Dianna J. Bowles
单位
University of York
杂志
Chemistry - A European Journal（2008）
DOI
10.1002/chem.200800548
所属领域
合成生物学
关键词
biotransformationsenzymesglycosidesglycosylationterpenoids
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解决的核心问题

萜类糖苷的化学合成存在产率低、底物范围窄（特别是仲醇和叔醇位点）等问题，且植物中天然含量有限；需要发现能识别萜类骨架的糖基转移酶作为生物催化剂，以实现绿色、高效的糖苷合成。

研究策略

以拟南芥小分子糖基转移酶（GTs）多基因家族共107个重组酶为平台，体外筛选其对9种模型萜类底物（如香叶醇、法尼醇、青蒿酸等）的活性；利用大肠杆菌全细胞生物转化系统再生UDP-葡萄糖，进行小规模及发酵规模的糖苷生产。

研究路线图

100%
化学合成缺陷：低产率、底物范围窄、无法糖基化仲/叔醇
策略：筛选拟南芥107个GTs对9种萜类底物的活性
鉴定出27个活性GTs，分类：G组→伯醇，L组→糖酯，D/H组→仲/叔醇
全细胞生物转化（E. coli + UDP-葡萄糖再生），小规模生产
结果：18h摩尔产率5%~52.8%；3L发酵罐产248mg香叶基糖苷，纯度>95%
结论：植物GTs可作为萜类糖苷合成的新生物催化剂，绿色可放大，支持仲/叔醇糖基化
代表酶：GT 73C5（D组，多种萜类糖苷）；GT 75D1（L组，青蒿酸葡萄糖酯）
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核心内容

针对萜类糖苷化学合成产率低、难以修饰仲醇和叔醇位点的问题，该研究以拟南芥107个小分子糖基转移酶重组酶为平台，系统筛选其对9种模型萜类底物的活性。经体外筛选，共鉴定出27个具有活性的酶，并明确了序列与底物识别的对应关系：G组偏好伯醇，L组作用于羧基形成糖酯，D/H组专一识别仲醇和叔醇。利用大肠杆菌全细胞生物转化系统再生UDP-葡萄糖，小规模18小时转化中摩尔产率为5%至52.8%；在3升发酵罐中，从764毫克香叶醇生成247毫克香叶基葡萄糖苷，6小时达到最高转化率41%，产物纯度超过95%。其中GT 73C5可糖基化包括芳樟醇、薄荷醇在内的多种底物，GT 75D1能生成青蒿酸葡萄糖酯。该工作证明了植物糖基转移酶可作为识别萜类骨架的新生物催化剂，全细胞转化提供了无需有机溶剂和重金属、可放大的绿色合成路线，实现了化学方法难以完成的仲/叔醇糖基化。

创新点

['首次系统地对拟南芥全部小分子GT家族进行萜类底物活性筛选，鉴定出27个具有活性的酶', '揭示了GT序列与底物识别的关系：G组识别伯醇（不论线性或环状），L组识别羧基形成糖酯，D/H组识别仲醇和叔醇', '证明全细胞生物转化可在3L发酵罐中生产数百毫克级萜类糖苷，纯度>95%']

研究对象（27）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
E. coli BL21 — 76E2 GT 76E2 催化 拟南芥UDP-糖基转移酶，家族1，属于系统发育H组
E. coli BL21 — 76E11 GT 76E11 催化 拟南芥UDP-糖基转移酶，家族1，属于H组，对青蒿酸有活性
E. coli BL21 — 76E12 GT 76E12 催化 拟南芥UDP-糖基转移酶，家族1，属于H组，对青蒿酸有活性
E. coli BL21 — 76D1 GT 76D1 催化 拟南芥UDP-糖基转移酶，家族1，属于H组，对青蒿酸有活性
E. coli BL21 — 84A3 GT 84A3 催化 拟南芥UDP-糖基转移酶，家族1，属于L组，对青蒿酸有活性
E. coli BL21 — 84A4 GT 84A4 催化 拟南芥UDP-糖基转移酶，家族1，属于L组，对青蒿酸有活性
E. coli BL21 — 84B2 GT 84B2 催化 拟南芥UDP-糖基转移酶，家族1，属于L组，对青蒿酸有活性
E. coli BL21 — 84B1 GT 84B1 催化 拟南芥UDP-糖基转移酶，家族1，属于L组，对青蒿酸有活性
E. coli BL21 — 75B2 GT 75B2 催化 拟南芥UDP-糖基转移酶，家族1，属于L组，对法尼醇有活性
E. coli BL21 — 75B1 GT 75B1 催化 拟南芥UDP-糖基转移酶，家族1，属于L组，对法尼醇有活性
E. coli BL21 — 75D1 GT 75D1 催化 拟南芥UDP-糖基转移酶，家族1，属于L组，用于全细胞生产青蒿酸葡萄糖酯
E. coli BL21 — 74E2 GT 74E2 催化 拟南芥UDP-糖基转移酶，家族1，属于L组，对法尼醇有活性
E. coli BL21 — 74F1 GT 74F1 催化 拟南芥UDP-糖基转移酶，家族1，属于L组，对法尼醇有活性
E. coli BL21 — 74F2 GT 74F2 催化 拟南芥UDP-糖基转移酶，家族1，属于L组，对法尼醇有活性
E. coli BL21 — 74D1 GT 74D1 催化 拟南芥UDP-糖基转移酶，家族1，属于L组，对法尼醇有活性
E. coli BL21 — 74B1 GT 74B1 催化 拟南芥UDP-糖基转移酶，家族1，属于L组，对法尼醇有活性
E. coli BL21 — 85A1 GT 85A1 催化 拟南芥UDP-糖基转移酶，家族1，属于G组，对法尼醇有活性
E. coli BL21 — 85A5 GT 85A5 催化 拟南芥UDP-糖基转移酶，家族1，属于G组，对法尼醇有活性
E. coli BL21 — 85A4 GT 85A4 催化 拟南芥UDP-糖基转移酶，家族1，属于G组，对法尼醇有活性
E. coli BL21 — 85A2 GT 85A2 催化 拟南芥UDP-糖基转移酶，家族1，属于G组，对法尼醇有活性
E. coli BL21 — 85A7 GT 85A7 催化 拟南芥UDP-糖基转移酶，家族1，属于G组，对法尼醇有活性
E. coli BL21 — 73C3 GT 73C3 催化 拟南芥UDP-糖基转移酶，家族1，属于D组，对法尼醇有活性
E. coli BL21 — 73C5 GT 73C5 催化 拟南芥UDP-糖基转移酶，家族1，属于D组，用于全细胞生产多种萜类糖苷，发酵产香叶基葡萄糖苷
E. coli BL21 — 73C6 GT 73C6 催化 拟南芥UDP-糖基转移酶，家族1，属于D组，对法尼醇有活性
E. coli BL21 — 73C1 GT 73C1 催化 拟南芥UDP-糖基转移酶，家族1，属于D组，对法尼醇有活性
E. coli BL21 — 71C2 GT 71C2 催化 拟南芥UDP-糖基转移酶，家族1，属于E组，对法尼醇有活性
E. coli BL21 — 88A1 GT 88A1 催化 拟南芥UDP-糖基转移酶，家族1，属于E组，对法尼醇有活性

关键发现

  1. 共27个GT（从107个中筛选）对9种模型萜类底物有活性
  2. 小规模全细胞转化18h摩尔产率从5%（法尼基葡萄糖苷）到52.8%（薄荷基葡萄糖苷）
  3. 3L发酵罐中从764mg香叶醇生成247mg香叶基葡萄糖苷，最高转化率41%（0.62mmol, 196mg产物）于6h达到
  4. 产物纯度>95%。GT 73C5能糖基化香叶醇、香茅醇、法尼醇、松油醇、紫苏醇、芳樟醇、薄荷醇
  5. GT 75D1能生成青蒿酸葡萄糖酯。

研究结论

植物GT可被鉴定为识别萜类骨架的新生物催化剂，全细胞生物转化提供了一条绿色、可放大的萜类糖苷合成路线，能化学合成法无法有效完成的仲/叔醇糖基化，且无需有机溶剂和重金属催化剂，满足“天然”产品法规要求。